肽的人工合成ppt課件

1、 第六章第六章 肽的人工合成肽的人工合成前言前言20世紀(jì)初，世紀(jì)初，fischer 創(chuàng)建蛋白質(zhì)的多肽構(gòu)造學(xué)說(shuō)創(chuàng)建蛋白質(zhì)的多肽構(gòu)造學(xué)說(shuō) 1932年，年，Bergmann采用芐氧羰?；鳛榘被S護(hù)基采用芐氧羰酰基作為氨基維護(hù)基 同時(shí)期同時(shí)期Curtius創(chuàng)建酰氯法，疊氮法活化羧基的肽鍵生成法創(chuàng)建酰氯法，疊氮法活化羧基的肽鍵生成法50年代初，年代初，Wieland等開(kāi)展了活化酯法和混合酸酐法等開(kāi)展了活化酯法和混合酸酐法1953年，年，Vigneaud初次化學(xué)合成了多肽激素催產(chǎn)素初次化學(xué)合成了多肽激素催產(chǎn)素1963年，年，Schwyzer合成合成24aa的促腎上腺皮質(zhì)激素的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)

2、1965年，我國(guó)合成年，我國(guó)合成51aa的牛胰島素的牛胰島素1979年，矢島治明液相法合成牛胰年，矢島治明液相法合成牛胰RNaseA(124aa)80年代，年代，Merrifield提出固相合成法；多肽合成儀不斷開(kāi)展提出固相合成法；多肽合成儀不斷開(kāi)展第一節(jié)第一節(jié) 肽化學(xué)合成原理和液相合成肽化學(xué)合成原理和液相合成根本步驟：根本步驟： 1. -氨基和氨基和-羧基以及側(cè)鏈的維護(hù)羧基以及側(cè)鏈的維護(hù) 2. 羧基的活化和肽鍵的構(gòu)成羧基的活化和肽鍵的構(gòu)成 3. 脫除維護(hù)基和純化脫除維護(hù)基和純化 Z2 Z1 Z2 Z1XNHCHCOOH + H2NCHCOOY H2O XNHCHCO-NHCHCOOY Z3

3、Z2 Z1 脫維護(hù)脫維護(hù) XNHCHCOOH + H2NCHCO-NHCHCOOY Z3 Z2 Z1 縮合縮合 XNHCHCO-NHCHCO-NHCHCOOY 維護(hù)基維護(hù)基全脫除全脫除 三肽三肽一一 氨基酸維護(hù)基氨基酸維護(hù)基 為了使肽鍵生成反響可以定向進(jìn)展，需求對(duì)氨基酸的各為了使肽鍵生成反響可以定向進(jìn)展，需求對(duì)氨基酸的各種官能團(tuán)進(jìn)展維護(hù)種官能團(tuán)進(jìn)展維護(hù)一一 -氨基維護(hù)基：氨基維護(hù)基： 常用：烷氧羰基、?；屯榛Ｓ茫和檠豸驶?、?；屯榛鶊F(tuán)結(jié)構(gòu)基團(tuán)結(jié)構(gòu)名稱名稱脫除條件脫除條件芐氧羰酰基芐氧羰?；▃）鈀炭催化氫化法鈀炭催化氫化法(H2/Pd) Na/液氨液氨, HF法等法等(CH3)3-CO-

4、CO-叔丁氧羰基叔丁氧羰基(Boc) 弱酸弱酸芴甲氧羰基芴甲氧羰基(Fmoc)堿脫除堿脫除: 20%呱啶呱啶/CH2Cl2-CH2O-CO- H CH2O-CO-二二 - -羧基維護(hù)基羧基維護(hù)基維護(hù)基種類相對(duì)較少維護(hù)基種類相對(duì)較少-羧基維護(hù)基種類：羧基維護(hù)基種類： 鹽：鉀鹽、鈉鹽、三乙胺鹽、三丁胺鹽等鹽：鉀鹽、鈉鹽、三乙胺鹽、三丁胺鹽等 鹽是對(duì)羧基的暫時(shí)性維護(hù)鹽是對(duì)羧基的暫時(shí)性維護(hù) 酯：甲酯和乙酯、芐酯、叔丁酯酯：甲酯和乙酯、芐酯、叔丁酯(最常用最常用三側(cè)鏈的維護(hù)：三側(cè)鏈的維護(hù)：20種種aa中有中有13種側(cè)鏈需求維護(hù)種側(cè)鏈需求維護(hù)Lys-NH2 和側(cè)鏈羧基和側(cè)鏈羧基:選擇與選擇與-氨基和羧基不

5、同的維護(hù)氨基和羧基不同的維護(hù)基基 Cys-SH: 甲基芐基、對(duì)氧芐基等三氟乙酸鉈甲基芐基、對(duì)氧芐基等三氟乙酸鉈/ TFA脫除脫除)羥基羥基aa(Ser,Thr,Tyr)：芐基、叔丁基：芐基、叔丁基酰胺基維護(hù)：酰胺基維護(hù)：2,4,6-三甲氧芐基等可用三甲氧芐基等可用TFA脫除脫除二二 肽鍵生成法肽鍵生成法根本思緒：使根本思緒：使-羧基活化為羧基活化為RCOX方式，加強(qiáng)羰基方式，加強(qiáng)羰基碳原子的正電性，便于碳原子的正電性，便于-氨基進(jìn)展親和攻擊而成肽氨基進(jìn)展親和攻擊而成肽一活化酯法：一活化酯法：方法：方法： 采用巰基、烷基、酚基和采用巰基、烷基、酚基和N-羥胺類物質(zhì)最羥胺類物質(zhì)最常用：常用：N,N

6、-二環(huán)乙基碳二亞胺，二環(huán)乙基碳二亞胺，DCC)與與N-維護(hù)維護(hù)aa作作用，使用，使-羧基活化為酯的方式，然后進(jìn)展成肽反響。羧基活化為酯的方式，然后進(jìn)展成肽反響。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 中間產(chǎn)物可以分別、結(jié)晶、保管，便于去除副產(chǎn)中間產(chǎn)物可以分別、結(jié)晶、保管，便于去除副產(chǎn)物物 氨基組分的末端羧基可以不維護(hù)氨基組分的末端羧基可以不維護(hù) 對(duì)酰胺基活化特別有效對(duì)酰胺基活化特別有效二二 縮合劑法：縮合劑法：重要的縮合劑：重要的縮合劑：DCC, DIC(二異丙基二異丙基DCC等等DCC接肽反響機(jī)理：接肽反響機(jī)理：-N=C=N-R-COOH-NH-C=N- OCOR-NH-CO-NH-N,N-二環(huán)己基脲二環(huán)己基脲DCU

7、RCO-NH-R +H2N-RR-COOH+ (R-CO)2O 對(duì)稱酸酐對(duì)稱酸酐O-?；艴；錒2N-RDCC-NH-CO-NH- 三三 疊氮法：疊氮法：是最古老的經(jīng)典肽鍵生成法是最古老的經(jīng)典肽鍵生成法(1902年，該法最少引起消旋年，該法最少引起消旋 O O O R-C-OCH3 H2NNH2 R-C-NHNH2 R NO2 R-C-N3 酰化氨基酸酰肼?；被狨ｋ?酰化氨基酸疊氮?；被岑B氮 O H2N-R R-C-NH-R + 堿堿 HN3 堿堿 四混合酸酐法：四混合酸酐法：50年代提出，簡(jiǎn)單、反響快、純度好，尤其適宜小年代提出，簡(jiǎn)單、反響快、純度好，尤其適宜小肽合成肽合成 R1

8、R1 Z-NH-CH-COOH 叔胺叔胺(Et3N) Z-NH-CH-COO- Et3+NH R1 O O RO-COCl Z-NH-CH-C-O-C-OR H2N-R2 成肽存在副成肽存在副反響反響三三 脫維護(hù)基及純化脫維護(hù)基及純化一一TFA法：法：方法：將產(chǎn)物置于三氟乙酸方法：將產(chǎn)物置于三氟乙酸(TFA)中處置，以脫中處置，以脫除維護(hù)基除維護(hù)基優(yōu)點(diǎn)：用于脫除一些不耐酸的維護(hù)基，溫暖，優(yōu)點(diǎn)：用于脫除一些不耐酸的維護(hù)基，溫暖，副反響少，尤其適宜于固相合成法。曾用于副反響少，尤其適宜于固相合成法。曾用于胰高血糖素合成。胰高血糖素合成。缺陷：缺陷：TFA用量較大，需維護(hù)的氨基酸種類較用量較大，需維

9、護(hù)的氨基酸種類較多等多等二二HF法：法：方法：以無(wú)水氟化氫方法：以無(wú)水氟化氫(HF) 在在0 20C處置處置3060min優(yōu)點(diǎn)：可脫除其他方法難以脫除的維護(hù)基，比優(yōu)點(diǎn)：可脫除其他方法難以脫除的維護(hù)基，比TFA法有效法有效缺陷：缺陷： HF腐蝕性強(qiáng)，脫除時(shí)副反響較多腐蝕性強(qiáng)，脫除時(shí)副反響較多三含硅試劑法、有機(jī)磺酸法等三含硅試劑法、有機(jī)磺酸法等四四 二硫鍵的生成二硫鍵的生成是蛋白質(zhì)合成中最困難的任務(wù)是蛋白質(zhì)合成中最困難的任務(wù)經(jīng)典方法：空氣氧化法、碘氧化法，收率低，副反響嚴(yán)重經(jīng)典方法：空氣氧化法、碘氧化法，收率低，副反響嚴(yán)重目前目前: 三氟乙酸鉈三氟乙酸鉈 (CF3COO)3Tl 法：法： 可先裂解

10、可先裂解Cys的各種維護(hù)基，然后金屬鉈作為弱氧化劑的各種維護(hù)基，然后金屬鉈作為弱氧化劑催化二硫鍵的生成，效率是碘氧化法的催化二硫鍵的生成，效率是碘氧化法的2倍倍 亞砜介導(dǎo)法亞砜介導(dǎo)法sulfoxid-directed): Cys亞砜和亞砜和CysR在酸處置下，生成的在酸處置下，生成的SH作用于亞砜的作用于亞砜的S原子，在亞砜位置處生成二硫鍵。用不同的原子，在亞砜位置處生成二硫鍵。用不同的Cys亞砜和酸處亞砜和酸處置，可在需求的位置定點(diǎn)生成二硫鍵。置，可在需求的位置定點(diǎn)生成二硫鍵。五五 合成肽的純化和純度鑒定合成肽的純化和純度鑒定純化：凝膠過(guò)濾、離子交換層析、反向純化：凝膠過(guò)濾、離子交換層析、反

11、向HPLC等等鑒定：薄層層析、等電點(diǎn)聚焦、分析鑒定：薄層層析、等電點(diǎn)聚焦、分析HPLC、質(zhì)、質(zhì)譜法譜法 等等六六 肽的液相法合成戰(zhàn)略與例如：肽的液相法合成戰(zhàn)略與例如：小肽合成：逐漸延伸法小肽合成：逐漸延伸法(stepwise elongation)，從，從C-端開(kāi)場(chǎng)端開(kāi)場(chǎng) 逐一合成，使肽鏈向逐一合成，使肽鏈向N末端延伸的方法末端延伸的方法大肽合成：片段縮合法大肽合成：片段縮合法(fragment condensation) ，先分段，先分段 合成小肽再縮合成大肽段，縮合時(shí)常用不易消旋合成小肽再縮合成大肽段，縮合時(shí)常用不易消旋 的疊氮法的疊氮法片段縮合法戰(zhàn)略：片段縮合法戰(zhàn)略： 劃分肽段：長(zhǎng)度普通

12、不超越劃分肽段：長(zhǎng)度普通不超越10個(gè)個(gè)aa殘基殘基 盡能夠以不易消旋的盡能夠以不易消旋的Gly、Pro等為肽的等為肽的C-端端 aa和維護(hù)基性質(zhì)對(duì)肽段純化難異的影響和維護(hù)基性質(zhì)對(duì)肽段純化難異的影響 構(gòu)象要素影響構(gòu)象要素影響 選擇接肽順序：小片段分頭縮和選擇接肽順序：小片段分頭縮和大片段大片段肽肽 (有時(shí)很難或不能進(jìn)展有時(shí)很難或不能進(jìn)展) 小片段逐一縮合小片段逐一縮合(反響步驟多但產(chǎn)率高反響步驟多但產(chǎn)率高) 較大片段逐一縮合常用較大片段逐一縮合常用) 例如：牛胰例如：牛胰RNase ARNase A124aa124aa的合成的合成將將RNase A分生長(zhǎng)短不一分生長(zhǎng)短不一30個(gè)片段，分別以逐漸延

13、伸法合成個(gè)片段，分別以逐漸延伸法合成從肽的從肽的C-端開(kāi)場(chǎng)，用疊氮法小片段依次接肽，得到維護(hù)的端開(kāi)場(chǎng)，用疊氮法小片段依次接肽，得到維護(hù)的RNase AN-端為端為Z(芐氧?；S氧?；?；C-端，端，OBzl(芐氧基芐氧基) Cys(對(duì)甲氧芐基，對(duì)甲氧芐基，Mbzl) 和和Met亞砜的復(fù)原，得到復(fù)原型維護(hù)亞砜的復(fù)原，得到復(fù)原型維護(hù)的的RNase A1mol/L三氟甲磺酸三氟甲磺酸/TFA脫維護(hù)；巰基乙醇脫維護(hù)；巰基乙醇 + 二硫蘇糖醇；二硫蘇糖醇； 過(guò)過(guò)Sephadex G-25層析柱，得到去維護(hù)基的層析柱，得到去維護(hù)基的RNase A 在谷胱苷肽存在下空氣氧化構(gòu)成二硫鍵，在谷胱苷肽存在下空氣氧

14、化構(gòu)成二硫鍵，Sephadex G-25，得到合成的，得到合成的RNase A 粗品粗品(活力活力18.9%)經(jīng)過(guò)親和層析，產(chǎn)物活力經(jīng)過(guò)親和層析，產(chǎn)物活力81.3%CM-纖維素層析，得到離子交換層析純產(chǎn)物纖維素層析，得到離子交換層析純產(chǎn)物95%乙醇處置，得到牛胰乙醇處置，得到牛胰RNase A結(jié)晶，酶活力結(jié)晶，酶活力100%第二節(jié)第二節(jié) 固相肽合成固相肽合成一、合成原理：一、合成原理： 1963年，年，Merrifield將將aa的的C-端固定在不溶端固定在不溶性樹(shù)脂上，然性樹(shù)脂上，然 后在其上依次進(jìn)展氨基后在其上依次進(jìn)展氨基酸縮合，延伸肽鏈。抑制了液相合成法酸縮合，延伸肽鏈。抑制了液相合成法

15、中每一步產(chǎn)物純化的困難，奠定了自動(dòng)中每一步產(chǎn)物純化的困難，奠定了自動(dòng)化肽合成的根底，化肽合成的根底， 為此，為此，Merrifield于于1984年獲得年獲得Nobel化學(xué)獎(jiǎng)化學(xué)獎(jiǎng)固相法合成較之液相法簡(jiǎn)單、快速，不固相法合成較之液相法簡(jiǎn)單、快速，不需每步純化中間物需每步純化中間物 固相法適宜固相法適宜1030aa的小肽，不流失的小肽，不流失 但固相法合成肽的純度差，大肽或高但固相法合成肽的純度差，大肽或高純、大量小肽合成采用液相法純、大量小肽合成采用液相法一一Boc固相法經(jīng)典固相法經(jīng)典Merrifield法法): 因氨基維護(hù)基采用可用因氨基維護(hù)基采用可用TFA脫除的脫除的Boc而而得名得名;

16、側(cè)鏈用芐醇類維護(hù)；側(cè)鏈用芐醇類維護(hù)； 樹(shù)脂為氯甲基化或羥甲基化聚苯乙烯樹(shù)脂為氯甲基化或羥甲基化聚苯乙烯,對(duì)乙酰氨基芐酯樹(shù)脂對(duì)乙酰氨基芐酯樹(shù)脂方法：方法： Boc-NH-CHR1-COO- + Cl- CH2-樹(shù)脂樹(shù)脂 C-末端末端aa與樹(shù)脂結(jié)合：與樹(shù)脂結(jié)合： Boc-NH-CHR1-COO-CH2-樹(shù)脂樹(shù)脂 用用TFA法脫除法脫除N-Boc CF3COO- - +NH3-CHR1-COO-CH2-樹(shù)脂樹(shù)脂 三乙胺中和、洗滌三乙胺中和、洗滌 NH2-CHR1-COO-CH2-樹(shù)脂樹(shù)脂 在在DCC存在下與存在下與Boc-aa耦聯(lián)，洗滌耦聯(lián)，洗滌 Boc-NH-CHR2-CO-NH-CHR1-COO

17、-CH2-樹(shù)脂樹(shù)脂 脫維護(hù)、反復(fù)接肽脫維護(hù)、反復(fù)接肽 Boc-NH-CHRn-CO- -NH-CHR1-COO-CH2-樹(shù)脂樹(shù)脂 全部維護(hù)基脫除，全部維護(hù)基脫除，HF法等法等 目的肽目的肽二二Fmoc固相合成法：固相合成法： Fmoc固相合成法的步驟與固相合成法的步驟與Boc固相合成法類似固相合成法類似不同之處：不同之處： 氨基維護(hù)基為：可用堿氨基維護(hù)基為：可用堿(20%呱啶呱啶)脫除的芴甲氧羰基脫除的芴甲氧羰基(Fmoc), 側(cè)鏈維護(hù)基為：可以用側(cè)鏈維護(hù)基為：可以用TFA脫除的叔丁基脫除的叔丁基 樹(shù)脂：采用樹(shù)脂：采用90% TFA可切斷的烷氧芐醇型可切斷的烷氧芐醇型 或或1% TFA可切斷的

18、二烷氧芐醇型可切斷的二烷氧芐醇型優(yōu)點(diǎn)：防止最終的強(qiáng)酸處置優(yōu)點(diǎn)：防止最終的強(qiáng)酸處置二、二、 自動(dòng)肽合成儀：自動(dòng)肽合成儀：1966年，年，Merrifield等報(bào)道了最初的自動(dòng)肽合成儀等報(bào)道了最初的自動(dòng)肽合成儀普通以普通以Boc或或Fmoc固相合成法為根底，將肽合成自動(dòng)化固相合成法為根底，將肽合成自動(dòng)化監(jiān)測(cè)：監(jiān)測(cè)： Fmoc有明顯的紫外吸收有明顯的紫外吸收第三節(jié)第三節(jié) 酶促肽合成和半合成酶促肽合成和半合成一、根本原理：一、根本原理： 利用蛋白水解酶催化肽鍵的構(gòu)成利用蛋白水解酶催化肽鍵的構(gòu)成優(yōu)點(diǎn)：反響條件溫暖；不引起優(yōu)點(diǎn)：反響條件溫暖；不引起aa消旋；消旋； 不要求不要求aa側(cè)鏈維護(hù)；副產(chǎn)物少，側(cè)鏈

19、維護(hù)；副產(chǎn)物少，后處置較簡(jiǎn)單后處置較簡(jiǎn)單1. 酶促合成多肽的酶類：酶促合成多肽的酶類：主要有四類：主要有四類：Ser蛋白水解酶；蛋白水解酶；HS-蛋白水蛋白水解酶；解酶； 羧肽酶；羧肽酶； 金屬蛋白酶類金屬蛋白酶類2. 對(duì)對(duì)aa成分的選擇：為使反響向肽鍵生成成分的選擇：為使反響向肽鍵生成方向進(jìn)展方向進(jìn)展二二 酶合成反響的幾個(gè)系統(tǒng)：酶合成反響的幾個(gè)系統(tǒng)：為了使反響定向進(jìn)展，將參與反響的氨基組分的羧基端和羧為了使反響定向進(jìn)展，將參與反響的氨基組分的羧基端和羧基組分的氨基端維護(hù)基組分的氨基端維護(hù)為提高合成反響效率，防止二次水解，創(chuàng)建一些特定的反響為提高合成反響效率，防止二次水解，創(chuàng)建一些特定的反響系

20、統(tǒng)，如：系統(tǒng)，如：1. 沉淀系統(tǒng)：降低產(chǎn)物溶解度，使其沉淀，防止水解沉淀系統(tǒng)：降低產(chǎn)物溶解度，使其沉淀，防止水解 如：如：Z-Phe-COOH + Z-Leu-NH2 Z-Phe-Leu-NH2 在凝乳酶在凝乳酶(200mol/L)催化下，催化下，PH7反響反響20hr，收率為，收率為70 80%。隨反響進(jìn)展溶液逐漸變褐色，黏稠化、最終完全固化。隨反響進(jìn)展溶液逐漸變褐色，黏稠化、最終完全固化2. 二相系統(tǒng)：將緩沖液與有機(jī)溶劑攪拌成乳濁液二相系統(tǒng)，二相系統(tǒng)：將緩沖液與有機(jī)溶劑攪拌成乳濁液二相系統(tǒng)，水相普通占水相普通占25%，底物和酶在水的懸滴中反響，但生成的，底物和酶在水的懸滴中反響，但生成的產(chǎn)物為脂溶性的。隨著反響地進(jìn)展，產(chǎn)物自動(dòng)轉(zhuǎn)移至有機(jī)相產(chǎn)物為脂溶性的。隨著反響地進(jìn)展，產(chǎn)物自動(dòng)轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中，不再與酶接觸。如：中，不再與酶接觸。如： Z-Glu-COOH + Ala-ODPM Z-Glu- Ala-ODPM(二苯甲酯二苯甲酯)三三 酶促半合成酶促半合成 ：對(duì)于無(wú)維護(hù)的大肽段的之間的定向銜接，無(wú)法