宏基因組實(shí)驗(yàn)計(jì)劃

1、宏基因組學(xué)方法研究明永冰川的初步實(shí)驗(yàn)計(jì)劃起草人：李浩宇宏基因組學(xué)研究方向及意義研究：環(huán)境脅迫對集體遺傳變異的過程和機(jī)理。發(fā)掘：環(huán)境應(yīng)激和應(yīng)答基因的多態(tài)性。探究：多態(tài)性基因的功能。實(shí)驗(yàn)大體步驟：I. 環(huán)境樣品的采集：1）避免人源污染，采樣的器具都要高溫滅菌，采樣過程中要戴手套。2） 樣品的迅速處理保存。 有條件最好用液氮冷凍運(yùn)輸， 沒有條件可以將裝有樣品的容器至 于干冰泡沫箱中。 帶回實(shí)驗(yàn)室之后要盡快處理， 特別是固體樣品， 迅速用預(yù)冷緩沖液 （ 多為3）如果后續(xù)用間接法提取總 離心，一般適用于水樣。PBS）重懸，離心收集沉淀。分裝成小份，凍存于液氮或者-80 °C冰箱中，避免反復(fù)凍融

2、。DNA的話，此處需要收集菌體，采取的策略是稀釋之后的差速提取方法的選擇：總 DNA 的提取按照處理樣品方式的不同劃分為 直接提取法 和間接提取法 。 直接提取法就是直接對樣品進(jìn)行裂解，釋放其中的DNA。間接提取法則是先分離樣品中的微生物，后對微生物進(jìn)行裂解。兩種方法的適用范圍不同， 各自都有優(yōu)缺點(diǎn)。直接提取法的優(yōu)缺點(diǎn) ：直接提取法多用在提取固體樣品 ( 如土壤、污泥、湖泊沉積物等 ) 總 DNA的試驗(yàn)中。其最大的優(yōu)點(diǎn)在于得率高，在某些環(huán)境樣品總DNA提取實(shí)例中，比間接提取法高數(shù)倍至數(shù)百倍。造成這種情況的最主要原因一是環(huán)境樣品中存在豐富的胞外DNA二是許多微生物與基質(zhì)形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)， 間接提取

3、法不易對其進(jìn)行分離。 在樣品較珍貴時(shí)多采 用此法。其缺點(diǎn)同樣明顯，所得 DNA 的純度遠(yuǎn)不及間接提取法所得，基質(zhì)中含的腐殖質(zhì)一 并被保留下來，使得所得DNA呈現(xiàn)黃褐色甚至黑色。可以考慮MoBio和Epicentre的DNA提取的商業(yè)試劑盒(主要用于提取土壤樣品)。間接提取法的優(yōu)缺點(diǎn) ：間接提取法則既可以用來提取固相樣品總DNA 也可以用來提取液體樣品總DNA在提取液體樣品(如海水、河流等樣品)總DNA時(shí)，需要用抽濾的方式濃縮。 與直接提取法剛好相反，其最大的優(yōu)點(diǎn)在于提取DNA純度高，既使在提取固體樣品微生物總 DNA 時(shí)，也可以用緩沖液對收集的菌體進(jìn)行反復(fù)沖洗以去除表面所帶雜質(zhì)。其缺點(diǎn)是 DN

4、A得率低。土壤 DNA 直接提取法：(1) 從超低溫冰箱中取出保存樣品 (5 g) ；(2) 于室溫融化；加入ml CTAB抽提緩沖液和50卩I蛋白酶K貯存液；(4) 離心管于 37oC 225 rpm 水平振蕩 30 min ；(5) 加入 mL20%SD；S(6) 65oC 水浴 2 h ，每隔 15 min 輕輕顛倒數(shù)次；(7) 室溫 6,000g 離心 10 min ，收集上清液，轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的 50 ml 離心管中；(8) 沉淀中再加入ml提取液和ml 20%SDS,輕輕渦旋至混勻；(9) 浸入液氮中冷凍 3 min 后，于沸水中煮沸 3 min ；(10) 室溫 6,000g 離心

5、 10 min ，收集上清液，與上次上清液合并；(11) 重復(fù) (8) 、 (9) 、 (10) 一次；(12) 將三次提取所獲上清液與等體積的苯酚：氯仿(1:1 v/v)混合，搖勻后于4 C12,000g 離心 10 min ；(13) 將上層水相轉(zhuǎn)移至一新的 50 ml 離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇 (24:1) ，混勻后于4 °C 12,000g 離心10 min ;(14) 再次轉(zhuǎn)移上清至一新的離心管中，加入 倍體積的異丙醇于室溫沉淀 1 h；(15) 室溫 12,000g 離心 20 min ；(16) 收集沉淀，用預(yù)冷的 70%乙醇洗滌沉淀；(17) 向離心管中加入

6、1 ml TE，于4 C放置過夜，分裝保存于-20 C。實(shí)驗(yàn)過程中的注意事項(xiàng)及一些技巧：(1) 整個(gè)提取過程吹吸動(dòng)作要輕柔，避免劇烈震蕩 (試劑盒提取除外 )。(2) 用到的槍頭在滅菌之前最好將頭部剪掉，避免機(jī)械剪切。(3) 酚氯仿抽提時(shí)，中間相一定不要吸到，寧可多丟棄一些。(4) 異丙醇沉淀時(shí)不要放在低溫， 倍體積室溫沉淀足夠了。(5) DNA溶解時(shí)可以放在4 C靜置過夜，次日離心取上清去除多余雜質(zhì)。(6) 水平震蕩可以用左右搖晃的震蕩器。水樣 DNA 間接提取法：(1) 抽濾的方式濃縮采集到的水樣。(2) 采取差速離心取得水樣中的菌體。(3) 取得微生物后進(jìn)行裂解提取。此方法還在查證中，具

7、體前期對樣品的處理方法還在整理中。 例如：用多少的水樣進(jìn)行濃縮，差速離心的轉(zhuǎn)速選擇。會不會有DNA的丟失等等。Epicentre 推出了宏基因組 DNA分離試劑盒(Metagenomic DNAsolation Kit for Water), 能從水樣中分離已隨機(jī)剪切的，可直接用于fosmid克隆的DNA片段。此試劑盒能從水樣中的培養(yǎng)或未培養(yǎng)微生物(包括革蘭氏陽性菌)中提取40kb 大小的DNA提取的DNA可立即進(jìn)行末端修復(fù)，并在乙醇沉淀洗滌后克隆到Epicentre 的PCC1FOS載體上。優(yōu)勢：1. 無需化學(xué)剪切，瓊脂糖塊或大小選擇。2. 無需純化柱或酚 /氯仿提取。3. 產(chǎn)量更高，從低豐

8、度的微生物中回收DNA的概率更大。載體與DNA的克隆只需要90分鐘。圖為方法與流程：粗提 DNA 的純化采用直接提取法提取的總 DNA 或多或少都含有腐殖質(zhì)的存在。它的存在對后續(xù)的分子生物 學(xué)操作會有影響，時(shí)常會導(dǎo)致PCR 擴(kuò)增不出來，酶切困難，連接轉(zhuǎn)化率低。需要進(jìn)行純化。純化的方法包括：膠回收，柱純化，電泳 / 電洗脫，梯度離心。a 膠回收膠回收最大的優(yōu)點(diǎn)在于快捷， 可以在很短的時(shí)間內(nèi)完成。 純化后的DNA往往能夠滿足PCR要 求。但其缺點(diǎn)在于，膜截留式的純化方式難免會對 DNA分子造成機(jī)械損傷，使得DNA彌散， 完整度下降。如果后續(xù)的實(shí)驗(yàn)室分析 16S r DNA，則這種純化方式不失為一種

9、好方法。b 柱純化柱純化相對于膠回收來說更為快速， 十幾分鐘內(nèi)可完成。 與膠回收相比， 其純化效果要差一 些。但通常情況下，純化之后的 DNA 也能夠滿足 PCR 需求。這種方法也會造成 DNA 分子的 機(jī)械損傷，使得 DNA 彌散，完整度下降。c 電泳 / 電洗脫電泳 /電洗脫法相對于前兩種有很多優(yōu)點(diǎn)：其一，其價(jià)格低；其二，整個(gè)過程都很溫和，能夠保證 DNA 的完整性；其三，純化后的 DNA 純度較之前兩種要好一些。但是其亦有些許不 便：其一，過程耗時(shí)長，包括透析袋的準(zhǔn)備，電洗脫，洗脫液的濃縮等；其二，DNA 損失量較前兩種大，透析袋上會殘留DNA如果樣品不是很珍貴，并且后續(xù)要進(jìn)行 Meta

10、genomic研 究，這種方法不失為一種好方法。 如果有脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)， 用此方法可以得到高純大片 段DNA可以滿足后續(xù)的 metagenomic C/Fosmid 文庫構(gòu)建。d 蔗糖 / 氯化銫密度梯度離心 如果實(shí)驗(yàn)室有超速離心機(jī) （100,000g 以上），那么這種方法無疑也是一種好方法。 與電泳電洗脫法相同，這種方法在連續(xù)介質(zhì)中對 DNA及雜質(zhì)進(jìn)行分離，可以很好的純化 DNA純化得 到的DNA經(jīng)過低熔點(diǎn)凝膠電泳切膠回收，可以得到高純度大片段的DNA可以滿足后續(xù)的metagenomic C/Fosmid 文庫構(gòu)建。純化質(zhì)量的檢測DNA 純化完畢之后往往需要對純化效果做一個(gè)初步的判斷，主

11、要包括兩方面： 其一， 完整度判斷；其二，純度判斷。a 完整度判斷完整度判斷同前所述，千萬要記得的是加純化之前的DNA 樣品做對照。結(jié)果可以告訴我們純化得率及完整度。同樣，最好能跑脈沖場凝膠電泳。b 純度判斷 純度判斷通?？梢圆捎脙煞N方法：分光光度計(jì)法和 PCR 擴(kuò)增法。分光光度計(jì)可以測定雙鏈 DNA 在 260nm 處的吸收值及雜質(zhì)在其他波長的吸收值。通過不同波長吸收值的比，可以對 DNA 純度做出判定。通常這種方法由于靈敏性較高，所以在存在雜質(zhì)時(shí)誤差較大。III. 所提 DNA 完整性檢測最好采用 % 瓊脂糖凝膠電泳， 低電壓DNA 的完整性主要采用普通瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行指示。長時(shí)間跑。至少要用 lambda DNA/Hind III 做 marker ，如果在 23 kb 處有一條完整或略拖 尾的帶，則證明 DNA 完整性尚好。如有條件，可以采用脈沖場凝膠電泳對提取DNA 的完整度進(jìn)行分析。用脈沖場凝膠電泳分析時(shí)，除了上面提及的那個(gè) maker ，至少還應(yīng)該