一文參透lncrna研究思路模式和數(shù)據(jù)庫應(yīng)用知識(shí)講解

1、一文參透：l ncr na研究思路、模式和數(shù)據(jù)庫應(yīng)用一文參透：IncRNA研究思路、模式和數(shù)據(jù)庫應(yīng)用 .作者：解螺旋.老談導(dǎo)語當(dāng)很多小伙伴還徘徊在miRNA時(shí)，IncRNA已經(jīng)橫空由世，還沒得來得及反應(yīng)過來IncRNA到底是怎么回事時(shí)，circRNA又開始嶄露頭角了。科研就是這樣，你落后一步， 便步步落后，跟娶媳婦生孩子是一樣一樣的。說回正題， 應(yīng)部分解螺旋粉絲的要求，今天老談幫大家整體梳理了曾 經(jīng)紅極一時(shí)、目前熱度不減的IncRNA的研究思路和模式以及相關(guān)工具，希望能對(duì)那些想在IncRNA研究上有所作為的小伙伴能助上一臂之力。IncRNA研究思路IncRNA參與了 X染色體沉默、基因組印記以

2、及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn) 錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程。很多人看到 IncRNA的熱度還沒有過去，經(jīng)常會(huì)問老談如果沒有相關(guān)的 工作基礎(chǔ)，如何開始IncRNA的研究？今天我們就褪去虛偽 外衣，研究的大方向是這樣子的：1.尋找到IncRNA 分子2. IncRNA 分子表型研究 3. IncRNA 通過何種機(jī)制調(diào)節(jié)表型？老談將這些研究方向及實(shí)驗(yàn)手段按層次的方式繪成流程 圖，如下所示：首先，是樣本的準(zhǔn)備與收集。高質(zhì)量的樣 本是實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可靠性的前提。其次，是IncRNA檢測(cè)?？梢韵韧ㄟ^芯片的方式高通量篩選 到目的基因，然后通過 q-PCR或Northern blot的方法驗(yàn)證 所得到的芯

3、片結(jié)果。再次，其研究方向根據(jù)研究目的而定。如果是研究生物標(biāo)志物，那么可以通過收集更多的臨床樣本，研究 IncRNA對(duì) 疾病的指示作用。如果是研究其功能，則是研究其細(xì)胞表 型、分子表型及機(jī)制。小伙伴們是不是覺得這和miRNA的總體研究思路相似呢？這時(shí)可以根據(jù)各自的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)條件選擇相應(yīng)的研究。值得 注意的是，IncRNA的功能研究并不像 miRNA 一樣通過3' UTR影響翻譯套路，總的來說 IncRNA機(jī)制研究套路還不 成熟。對(duì)于很多科研工作者而言，IncRNA分子的獲得及其細(xì)胞表型的獲得并非難事，關(guān)鍵在于如何進(jìn)行下一步研 究，這時(shí)候就要涉及到對(duì)功能研究的定位。歸納如下： IncRNA的

4、功能分為3方面：1 .通過修飾染色體參與表觀調(diào)節(jié)；2.通過與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；3.通過影響mRNA處理過程參與轉(zhuǎn) 錄后調(diào)節(jié)。在以上 3個(gè)方向的研究中，其中轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)相對(duì) 簡單，大家在選擇lncRNA的時(shí)候，可以對(duì)其序列做一下分 析，看看自己研究的lncRNA是作為miRNA的sources還是 sinks?另外兩方面的調(diào)節(jié)機(jī)制均涉及 RNA-蛋白質(zhì)的相互作用。在沒有目的蛋白的時(shí)候，此時(shí)不得不使用先進(jìn)技術(shù)，用于檢測(cè)RNA-蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)手段如下：RNA-蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)手段有 nRIP、CLIP; IncRNA由于其長片段核昔酸序列，則堿基之間相互作用，通常具有二級(jí)結(jié)構(gòu)，

5、可通過RNase足跡等實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行探討；在染色體結(jié)構(gòu)修飾作用中，還會(huì)涉及 RNA-RNA的相互作用，可通過CHIRP等實(shí)驗(yàn)手段來研究。由于上述實(shí)驗(yàn)手段比較難得，IncRNA的機(jī)制研究相對(duì)還是比較困難。那我們?cè)撛鯓舆M(jìn)行IncRNA研究呢？咱換個(gè)思路，不要將 IncRNA作為一個(gè)調(diào) 節(jié)分子，而是把IncRNA當(dāng)做和mRNA 一樣的分子來研 究，盡管很少表達(dá)蛋白。在體外，可以通過分子干擾手 段，進(jìn)行分子及表型研究；在體內(nèi)，也是如此。兩者通過各種組合，那就等著發(fā) 5分的文章吧。LncRNA研究模式我 們先來談一談“老瓶”一一基因研究模式。首先向大家灌輸“文章模塊化拆解的核心思想”。打個(gè)比喻，不管是億萬

6、富翁還是街頭的流浪漢，作為人這個(gè)物種，他都有手腳心肝肺等，即使他們的外在地位不一樣，但作為 物種來講，他們組成形式都差不多?；A(chǔ)科研的文章也一 樣，十篇文章可能有十個(gè)分值，但是他們的組成模塊其實(shí) 差不多，都是由“領(lǐng)域”、“分子”、“效應(yīng)”、“通路”組成（如下 圖所示），不同的文章就是不通模塊的組合。上面這個(gè)研究模式大家是不是很親切？其實(shí)，IncRNA研究也可以裝進(jìn)上面那個(gè)老瓶里，只不過把“ gene”換成IncRNA ”而已。下面 是一個(gè)IncRNA普通模板實(shí)例：領(lǐng)域（膽囊癌）、分子（IncRNA）、效應(yīng)方法驗(yàn)證（敲減效率）、細(xì)胞層次（MTT實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)移小室、克隆形成實(shí)驗(yàn)）和動(dòng)物層次。這篇文章并

7、不涉及機(jī)制研究，所以各位小伙伴是不是覺得分 外眼熟？除去機(jī)制研究，和普通基因的研究模式是不是很 接近呢！基本套餐的IncRNA和基因研究不同點(diǎn)在于機(jī)制研究，兩者 的研究手段不一樣。IncRNA機(jī)制研究的常用技術(shù)為： RACE 技術(shù)、RNA pulldown 技術(shù)、RIP （RNA immunoprecipitation ）技術(shù)。幸運(yùn)的是，目前 lncRNA不需 要做到機(jī)制層面也能發(fā)表一篇 2-3分檔次的SCI,有興趣的 小伙伴還不趕緊小試身手！經(jīng)典的教科書上所記錄的中心法則：DNA -RNA一蛋白。但是隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，非編碼RNA已經(jīng)越來越顯示由重要的功能。經(jīng)過將近十年的深入研究，研

8、究者已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)了多種lncRNA的作用模式。但是面對(duì)紛繁復(fù)雜的 lncRNA作用模式，小伙伴們是不是感到無從下手？今天老 談就把lncRNA的作用模式總結(jié)一下，希望幫助小伙伴們更 好地理解。IncRNA的作用模式可以分為四大類 ：signal, decoy, guide, scaffold o1、signal: IncRNA的第一種作用是調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄。已 有研究發(fā)現(xiàn)，不同的刺激條件和信號(hào)通路下，IncRNA將會(huì)被特異性地轉(zhuǎn)錄，并作為信號(hào)傳導(dǎo)分子參與特殊信號(hào)通路 的傳導(dǎo)。一些IncRNA分子被轉(zhuǎn)錄后，擁有調(diào)控下游基因轉(zhuǎn) 錄的作用。從生物體的角度而言，利用RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控是具有明顯優(yōu)勢(shì)的，因

9、為利用 RNA進(jìn)行調(diào)控，且不涉及蛋 白質(zhì)的翻譯，因此具有更好的反應(yīng)速度，對(duì)于機(jī)體的某些 急性反應(yīng)可以做由更好更迅速的反應(yīng)。2 、 decoy:IncRNA的第二種作用是分子阻斷劑。這一類 IncRNA 被轉(zhuǎn)錄后，會(huì)直接和蛋白（一般都是轉(zhuǎn)移因子/轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子）結(jié)合，從而阻斷了該分子的作用和信號(hào)通路。由于 IncRNA的結(jié)合，這類轉(zhuǎn)錄因子的功能被阻斷，從而調(diào)控下 游的基因轉(zhuǎn)錄。3、guide:第三種作用模式是IncRNA與蛋白結(jié)合（通常是轉(zhuǎn)錄因 子），然后將蛋白復(fù)合物定位到特定的DNA序列上。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA介導(dǎo)的這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用可以是順式作用模 式，也可以是反式作用機(jī)制，因此僅僅從lncRNA

10、的序列上是無法獲得信息的。4、scaffold : IncRNA還可以起到一個(gè)“中心平臺(tái)”的作用， 即多個(gè)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子都可以結(jié)合在這個(gè)IncRNA分子上。在細(xì)胞機(jī)體中，當(dāng)多條信號(hào)通路同時(shí)被激活，這些下游的 效應(yīng)分子可以結(jié)合到同一條IncRNA分子上，實(shí)現(xiàn)不同信號(hào)通路之間的信息交匯和整合，有利于機(jī)體/細(xì)胞迅速地對(duì)外界信號(hào)和刺激產(chǎn)生反饋和調(diào)節(jié)。需要注意的是，雖然IncRNA的作用模式可以總結(jié)為上述四 種，但是這四種作用機(jī)制和模式是相互關(guān)聯(lián)，而非相互排 斥的。千萬不要孤立且割裂地看待IncRNA的作用方式，這樣會(huì)使視野受限，不利于更好地理解IncRNA的機(jī)制。IncRNA的常用數(shù)據(jù)庫大全有關(guān)所有I

11、ncRNA全方面的功能研究還需要進(jìn)一步的探索，少不了需要裝配研究的利器， 幫助我們?cè)趯で笙嚓P(guān)IncRNA信息時(shí)能夠手到擒來，不費(fèi)吹 灰之力！今天老談就跟大家分享一些研究IncRNA的數(shù)據(jù)庫，幫助大家做好科研準(zhǔn)備工作。1.NONCODE :NONCODE提供對(duì)長鏈非編碼 RNA的全面注釋，包括表達(dá) 和ncFANs計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)的IncRNA功能。這是非編碼 RNA研究的知名數(shù)據(jù)庫，已經(jīng)更新到2014年的8月了。網(wǎng)址：Note :小伙伴們要小心使用 時(shí)，可能由現(xiàn)的各種狀況，因?yàn)檫@個(gè)網(wǎng)站對(duì)lncRNA的命名方法是他們網(wǎng)站內(nèi)部命名的系統(tǒng)！ ！要哭了有沒有，根本

12、找不到你要的IncRNA但有個(gè)辦法解決，因?yàn)樗麄兊木W(wǎng) 站有Blast系統(tǒng)，你如果有IncRNA序列的話，還是能找到 對(duì)應(yīng)的編號(hào)的。對(duì)于IncRNA在不同組織中的表達(dá)的研究還 是挺有用的。2.lncRNAdb:提供有生物學(xué)功能的長鏈非編碼 RNA的全面注釋。這是長 鏈非編碼RNA研究領(lǐng)域的大牛Johnmattick實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的網(wǎng) 站。網(wǎng)址：/Note :這個(gè)用下來憑良心說 還行，輸入lncRNA名稱之后，會(huì)對(duì)這個(gè)lncRNA的功能及 表達(dá)進(jìn)行注釋。這個(gè)網(wǎng)站用的是NCBI上Gene的命名法，使用上還是沒有障礙的。3.CHIPbase:提供長鏈非編碼 RN

13、A的表達(dá)圖譜和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的全面鑒定和 注釋，整合了高通量的 RNA-seq鑒定的lncRNA及其表達(dá) 圖譜和ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)技術(shù)鑒定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。網(wǎng)址： 中大的這個(gè)數(shù)據(jù)庫主要是對(duì)于一些lncRNA的表達(dá)及l(fā)ncRNA與轉(zhuǎn)錄因子之間的關(guān)系的一個(gè)注釋數(shù)據(jù)庫。主要可以了解與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的lncRNA的結(jié)合情況。要調(diào)取lncRNA的表達(dá)數(shù) 據(jù)，勸你選別的數(shù)據(jù)庫，因?yàn)檫@個(gè)網(wǎng)站極其坑爹，只能輸 入GeneSymbol,并不是基因名，其實(shí)是 lncRNA的轉(zhuǎn)錄 名，一般是什么“RP11-XXXX ”。舉個(gè)例子：lncRNA2-1的 基因名其實(shí)是“LncRNA2.7 "，轉(zhuǎn)錄名是RP11-3

14、4P13.8”，這 需要注意哦。4.LncRNome :超過18000轉(zhuǎn)錄本目前已作為IncRNA標(biāo)注，覆蓋先前注釋 非編碼轉(zhuǎn)錄本，包括大型基因間非編碼RNA、反義RNA和加工的假基因。但在提供穩(wěn)定的注釋，交叉引用和生物相 關(guān)的信息資源方面有顯著的差距。由印度CSIR基因組和整合生物學(xué)研究所的研究人員開發(fā)的IncRNome ,旨在填補(bǔ)這一空白，他們通過把生物顯著性的各種各樣的信息注釋整 合到一個(gè)全面的知識(shí)庫。網(wǎng)址：http:/genome.igib.res.in/lncRNomeNote :三哥三姐確實(shí)NB,但記?。翰樵兊脑?，還是轉(zhuǎn)錄名：“ RP11-XXXX ”那 種，也有其他命名法的“ H

15、AS-LNCXXXX ”這種。功能上挺強(qiáng) 大，有l(wèi)ncRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，lncRNA的蛋白互作功能預(yù) 測(cè)，還有l(wèi)ncRNA的SNP位點(diǎn)。總的來說還不錯(cuò)，就是搜 索起來麻煩點(diǎn)。5.Starbase:一個(gè)高通量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) CLIP-Seq (或稱為HITS-CLIP, PARCLIP ,iCLIP )和mRNA降解組測(cè)序數(shù)據(jù)支持的microRNA靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫，包含了 miRNA-mRNA , miRNA-lncRNA , miRNA-circRNA , miRNA-ceRNA 和 RNA-protein 等的調(diào)控關(guān)系。整合和構(gòu)建多個(gè)流行的靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件的交集和調(diào)控 關(guān)系。網(wǎng)址： 要功能就是查詢IncRNA與miRNA的互作，蛋白及 IncRNA的互作，以及正在火的 ceRNA預(yù)測(cè)。不過主要功 能其實(shí)還是在miRNA上。6. LncRNADisease:提供了文獻(xiàn)報(bào)道的疾病相關(guān)的長鏈非編碼RNA的注