膠回收DNA注意事項(xiàng)

1、膠回收DNA考前須知1切膠回收 DNA 片段是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。 所以為了減少膠的體積，我們 就可以用相比照擬薄的膠來跑電泳， 通常只要夠點(diǎn)樣即可，或是采用薄而寬的梳子來跑膠。這樣可減少回 收試劑引起的一些后續(xù)麻煩。2主要還是 DNA 的濃度，如果 DNA 濃度不夠，想膠小點(diǎn)也不可能。3紫外燈下切下含待回收 DNA 的凝膠時(shí)，要襯以干凈的塑料薄膜， 使用無 DNA 污染的新刀片， 其目的在于防止外源 DNA 的污染。4利用凝膠回收試劑盒 DNA 回收效率較低或者未回收到目的片段可 能有以下幾個(gè)原因：膠塊未完 全溶解，可適當(dāng)延長水浴時(shí)間，并增 加上下顛倒次數(shù)輔助溶解；膠塊體積

2、太大，應(yīng)先將其切為小塊，分多次回收；電泳緩沖液 pH 太高，硅基質(zhì)膜在高鹽低 pH 結(jié)合 DNA,如 pH 太高，應(yīng)作適當(dāng)調(diào)整；漂洗液中未參加無水乙醇。5可以改用去離子水洗脫。 但是實(shí)驗(yàn)室所用純水一般 pH 偏低， 可利 用 NaOH適當(dāng)調(diào)高其 pH 值，以增加洗脫得率。6洗脫產(chǎn)物含有殘留的乙醇會影響后續(xù)酶切實(shí)驗(yàn)，請確保徹底去除 漂洗緩沖液，具體方法參見回收 效率低的解決方案。7不可以使用更小洗脫體積小于說明書提供的最小洗脫體積進(jìn) 行洗脫以提高濃度，因?yàn)檎f明書 提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋 吸附膜的最小體積，假設(shè)減少體積那么不能將 DNA 完全洗脫下來。8電泳檢測只有一條目的帶，可以選用凝膠

3、回收試劑盒。如果后續(xù) 實(shí)驗(yàn)對片段純度要求較高，建議 即使只有一條帶，也可以切膠純化, 其回收得到片段的純度可能要比直接回收高一些。9瓊脂糖凝膠膠塊不溶可能是下述原因：瓊脂糖質(zhì)量不好；含目的 片段的凝膠再空氣中放置過久， 使膠塊失水、 枯燥，建議切膠后立即進(jìn)行回收或?qū)⒛z塊保存在 4C 或-20C ;制膠的電泳緩沖液濃度過高 或陳舊。關(guān)于膠回收切膠的一點(diǎn)考前須知1. 電泳的 buffer 和 gel 都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源dna 污染。2. 切膠是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的 體積，可以用相比照擬薄的膠來做，只要夠

4、點(diǎn)樣即可，也可采用薄而 寬的梳子來跑膠。3. 關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼 睛，如果戴樹脂眼鏡就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者對于膠 有特殊要求，例如要求不含 EB,可以采用點(diǎn) marker 和帶刻度的尺子 一起照相的方法來確定目的條帶在膠上的位置進(jìn)行切膠。4. 按照正常程序點(diǎn) marker 跑膠，然后切下有 marker 的膠，EB 染色,紫外燈下與帶刻度的尺子一起照相。由于要回收的帶與marker 間的相對位置已 知，根據(jù)尺子來衡量未染色膠上目的帶的位置即可。如 果覺得很難判斷，可以直接在 marker 邊點(diǎn)少量的樣，這樣位置就容 易確定了。膠回收一. 提高

5、膠回收量的方法：1 增加電泳時(shí)的上樣量。2 電泳緩沖液用新鮮配制的。3 切膠時(shí)盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的 膠就不要要了，不然影響回收率。4 把切的兩塊或多塊膠融化后，無論多大的體積都用一個(gè)管子，轉(zhuǎn) 移到同一個(gè)柱子上。5 溶膠時(shí)所加的溶液可多一點(diǎn)，這樣更有利于 DNA 與膜的結(jié)合，不 過一般不要多余 750ul。6 膠回收的關(guān)鍵是通過柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性電荷和疏 水性使 DNA 與柱子結(jié)合，因此，假設(shè)電泳緩沖液的 PH 偏高，可在溶膠 液中參加 10ul PH 5.0, 3mol/L 的 NaAQ ;為了使 DNA 分子更好 的 攔截在膜上，可以添加 30%異丙醇在

6、加熱溶解膠后的液體里。7加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘大約需10 分鐘，以使乙醇充分揮發(fā)。段最后少加些洗脫液， 盡量減少回收體積， 一般用 30-50 引洗脫液洗 脫 不能太少，否那么無法浸濕膜反而不利于洗脫；洗脫液滴在膜中 央，以充分洗脫結(jié)合在膜上的 DNA。9 可以在參加洗脫液之后，可以在 55 度水浴 5 分鐘或放在 50 度水 浴 10分鐘以上再洗脫，或用封口膜密封 4 度過夜，第二天再離心回 收，效果不錯(cuò)。10將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。二. 幾種 PCR 產(chǎn)物回收的詳方法和步驟1 普通膠回收如果要膠回收，最好還是用試劑盒，方便，回收率也略高，實(shí)在要手 工回收，可以切

7、膠后參加 3 倍體積 TE,水浴熔化后，酚、酚/氯仿 抽提干凈，乙醇沉淀 即可。另外好似還有冷凍法，沒作過，不是很 清楚。2 從低熔點(diǎn)凝膠回收 DNA純化 DNA 片段 加與凝膠體積相等的 TE 10mmol/l Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/l EDTA，置 65C 水浴 5 分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放 至室溫，加等量酚TE 飽和，TE 封在上層，取下層酚，輕輕混勻不 用混 勻，12000rpm, 3 分鐘離心。反復(fù) 1-2 次。取上層液，力口 0.1 體積 3mol/L醋酸鈉pH5.2和 2.5 倍體積無水乙醇，進(jìn)行乙醇沉淀。 將 純化的 DNA加適量 TE 溶解，測定

8、含量，備用可用于目的基因 結(jié)構(gòu)分析，探針制備等。3 擴(kuò)增特異性好的 PCR 回收如果 PCRT 增特異性好，只是簡單的 PCR 產(chǎn)物純化回收，可以在 PCR 產(chǎn)物中參加 50ug/ml 的蛋白酶 K, 37 度 1h,酚/氯仿抽提一次，氯 仿抽提一次，上清參加 0.1 體積的醋酸鈉，2.5 體積的無水乙醇沉淀 回收。三. 不需膠回收就可直接連接的方法 1低溫冷凍析出法跑電泳時(shí)用低熔點(diǎn)的 agarose 膠，跑到一定時(shí)候，將目的條帶所在的 那一段膠切下，盡量切干凈，讓核酸直接暴露在膠的外表，并且，把 底下沒有脫氧 核酸的那點(diǎn)膠也盡量切掉，然后放入 1.5ml EP 管中， 然后放在負(fù)75 度冰箱

9、中 10-30 分鐘，接著 1, 300rpm 離心 5- 10 分鐘，取 10ul 上清，參加連接體系中。將其余的液體也吸出，儲存 在 另一個(gè)管子中，做好標(biāo)記，放在20 度備用。2酶切后的直接連接在你酶切后可以直接的參加連接酶和另外的片斷進(jìn)行連接是可以篩 選出連接好的片斷的.四、一些考前須知1.電泳的 buffer 和 gel 都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片最好 洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源 DNA 污染。2.切膠是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體 積，可以用相比照擬薄的膠來做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬 的梳子來跑膠。3.關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻

10、璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛， 如果你戴樹脂眼鏡就可以了。4. 瓊脂糖對回收率有一定影響，如果瓊脂糖較多，可以增加溶膠液， 保證體系鹽濃度。影響回收率的因素主要是柱子填料必須在適宜的緩 沖環(huán)境中如果用 柱子的話。對于小于 1 0 0 b p 的片段回收，可 加至 30%#丙醇。5. 如果是用 PAGE收，用水或 TE 溶解，槍頭搗碎，過夜浸泡，即可。 當(dāng)然你要將 100bp 在膠中位置定好切下。已標(biāo)記的探針用 X 片，未標(biāo)記的用 EB6.選用回收效率較高的柱子，比方進(jìn)口的 Qiaquick spin column7. 參照分子克隆 用低熔點(diǎn)膠回收。除低熔點(diǎn)凝膠回收法外，如用一 般凝膠可

11、用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法 回收 DNA片段。附注：1. 影響 DNA 在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：1 DNA 分亍大小 遷移速率 U 與 logN 成反比N 為堿基對數(shù)目。分 子大小相等，電荷根本相等DNA 結(jié)構(gòu)重復(fù)性。分子越大，遷移越 慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電泳快超 螺旋線性 DNA2 瓊脂糖濃度：logU=logU0 Krt 膠濃度，U 為遷移率，U0 為 DNA 的 白由電泳遷移率，t 為膠濃度，Kr 為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度， 分辨不同范圍的 DNAAgarose 0.5%: 1-30 kb; 0.7%: 0.8-12 kb1.2%: 0.4-7 kb; 1.5%: 0.2-3 kb.3 DNA 構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀 線狀 DNA 律鏈開環(huán)。當(dāng)條件 變化時(shí)，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及 EB 含量有關(guān)。4 所加電壓：低電壓時(shí)，線狀 DNA 片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm5 堿基組成與溫度：一般影響不大 4 -30 C6 嵌入染料的存在：降低線性 DNA 遷移率，不提倡加在電泳液中7電泳緩沖液 0.5 X TB 由勺組成及其離子強(qiáng)度影響 DNA 的遷移率， 無離子存在時(shí)，核酸根本不泳動，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠 并導(dǎo)