紫杉醇的提取工藝設(shè)計(jì)研究方案

1、紫杉醇提取純化方法的研究進(jìn)展紫杉醇是最早從紅豆杉屬植物中分離出來的三環(huán)二菇類化合物，是繼阿霉素 和順伯之后最熱點(diǎn)的抗癌新藥。紫杉醇具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分子由3個(gè)主環(huán)構(gòu)成二 菇核，分子中有11個(gè)手性中心和多個(gè)取代基團(tuán)，母環(huán)部分是一個(gè)復(fù)雜的四環(huán)體系， 有許多功能基團(tuán)和立體化學(xué)特征。分子式C47H5小。4,分子量853.92。同位素示蹤表明，紫杉醇只結(jié)合到聚合的微管上，不與未聚合的微管蛋白二聚體 反 應(yīng)。細(xì)胞接觸紫杉醇后會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積累大量的微管，這些微管的積累干擾了細(xì)胞的各種功能，特別是使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂期，阻斷了細(xì)胞的正常分裂。通 過U-川臨床研究，紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對(duì)肺癌、大

2、腸癌、黑色素 瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。紫杉醇屬于有絲分裂抑制劑，它的獨(dú)特機(jī)制在于可以誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白聚 合，促進(jìn)微管裝配及阻止微管的生理解聚，由此抑制癌細(xì)胞紡錘體的形成，阻止 有 絲分裂的完成，使其停留在G2期和M期直至死亡，從而起到抗癌的作用。迄今為 止紫杉醇是唯一促進(jìn)微管聚合的新型抗癌藥。這一新的發(fā)現(xiàn)引起了各國醫(yī)藥界的極大 興趣?，F(xiàn)在已有包括我國在內(nèi)的十多個(gè)國家批準(zhǔn)了紫杉醇類藥物的正式生 產(chǎn)。目前有 吳紫杉醇研究的幾個(gè)主要問題是：紫杉醇的提??；紫杉醇的人工合成；紫杉醇的臨 床應(yīng)用（水不溶性問題的解決）；紫杉醇的構(gòu)效關(guān)系；紫杉醇的抗癌機(jī)理。紫杉醇 的抗癌機(jī)理1971年,W

3、ani等報(bào)道了紫杉醇在一些實(shí)驗(yàn)體系中具有抗癌活性。1978年,Sch卅等發(fā)現(xiàn)紫杉醇在極低的濃度下（0.25 p M）可以完全抑制Hela細(xì)胞的分裂, 而且在對(duì)細(xì)胞4小時(shí)的培養(yǎng)過程中對(duì)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成沒有明顯影響Hela細(xì)胞在與紫杉醇共同溫育20小時(shí)后被阻斷在G2后期和期。979年Schiff 等用濁度法進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)紫杉醇能縮短微管在體外的聚合時(shí)間，使平衡向微管 聚合方向移動(dòng)，從而減小微管聚合臨界濃度。在有GTP時(shí),紫杉醇可以和PC-tubulin 結(jié)合，計(jì)量比為1 ：1他們還發(fā)現(xiàn)紫杉醇不影響純化的Act in的聚合(紫杉醇20 rl M)。目前，有關(guān)紫杉醇的抗癌機(jī)理的研究仍是一

4、個(gè)非?；钴S的領(lǐng)域。最 近的一些進(jìn)展是Tatebe等發(fā)現(xiàn)紫杉醇能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；Kavallaris等首次報(bào)道了紫 杉醇抑制卵巢上皮腫瘤與改變特定B-tubulin基因的表達(dá)有關(guān);Vater等通過電鏡和掃描力顯微鏡發(fā)現(xiàn)在Ca2+和紫杉醇存在下，微管蛋白的聚合發(fā)生畸變Dring等 發(fā)現(xiàn)紫杉醇還可調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能，促進(jìn)釋放腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、以及干擾 素，對(duì)腫瘤細(xì)胞起抑制或殺傷作用。而且這種畸變結(jié)構(gòu)隨著加入紫杉醇和Ca2+的順序不同而有所不同。紫杉醇的來源1963年美國化學(xué)家瓦尼(M C Wani)和沃爾(MonreE Wall)首次從一種生長在美國西部大森林中的短葉紅豆杉樹皮和木材中得到了紫杉

5、醇的粗提物并發(fā)現(xiàn)其具 有抗癌活性。但直到1969年，紫杉醇單體才被分離出來。此后，在紅豆杉屬的多種 植物中均發(fā)現(xiàn)有紫杉醇存在。紅豆杉屬植物為紅豆杉科常綠喬木或灌木 界共11種分布于北半球的溫帶至亞熱帶地區(qū)，包括短葉紅豆杉(Taxus brevifolia),歐洲紅豆杉(T.baccata),云南紅豆杉(T.yunnanensis),中國紅豆杉(T. chinensis)等。在歐洲，更為常見的是歐洲紅豆杉(Taxus baccata),具有明顯的毒性，常有牲畜 和人誤食中毒的事情發(fā)生其毒性源于所含有的有毒生物堿紫杉?jí)A(taxineA、B);因而后來有一個(gè)有趣的觀點(diǎn)：如果當(dāng)年在NCI抗癌活性成分篩

6、選計(jì)劃中沃爾和瓦尼 拿到的是T.baccata而非T.brevifolia的樹皮，要么會(huì)因萃取物的毒性而停止分 離，要么只能得到紫杉?jí)A，都不會(huì)有機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn)Taxol o幸運(yùn)的是，美國農(nóng)業(yè)部的收集計(jì)劃中送來的唯一樣品是T.brev訐。lia,而其中紫杉?jí)A的含量極微，紫杉醇從而有幸 成 為30年來最為公眾矚目的植物來源的化合物。迄今為止，紅豆杉屬植物仍是紫杉醇 的最重要的來源。除了可從其樹皮和枝葉中直接分離得到紫杉醇外，其樹葉中含量 很高的10-去乙酰巴卡亭III也是人工半合成紫杉醇的原料。此外，紫杉醇還可以從 全人工合成、真菌發(fā)酵、細(xì)胞培養(yǎng)及生物合成等途徑獲得。紫杉醇提取工藝隨著人們對(duì)紫杉醇研究的

7、不斷深入和完善，化學(xué)合成、基因工程、細(xì)胞培養(yǎng)、 真菌發(fā)酵等方法均可以成功獲得紫杉醇，但這些方法應(yīng)用于紫杉醇的生產(chǎn)依舊停 留在 實(shí)驗(yàn)室研究階段。目前，國內(nèi)外紫杉醇的商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)多以紅豆杉植物為原料，通 過一系列的分離純化獲得。針對(duì)紅豆杉資源嚴(yán)重匾乏的現(xiàn)狀，相關(guān)生產(chǎn) 企業(yè)采用人 工培植的方法經(jīng)過科學(xué)合理的選種育種栽培，加大紅豆杉植物的人工 培植規(guī)模，為紫 杉醇的生產(chǎn)提供相對(duì)充足的原料供給。在細(xì)胞組織培養(yǎng)和基因工 程技術(shù)等方法應(yīng)用到 紫杉醇的工業(yè)化生產(chǎn)之前，植物提取法仍是紫杉醇的主要來源。因此，開發(fā)出一套操 作簡便、快速高效的紫杉醇提取分離純化技術(shù)無疑對(duì)紫杉醇原料藥的產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀發(fā)揮積 極作用。紫杉醇

8、的提取過程可分為粗提和純化兩個(gè)階段。紅豆杉植物經(jīng)粉碎干燥等預(yù)處 理后，進(jìn)入紫杉醇的粗提工藝程序。粗提階段的目的在于選擇合適的提取溶劑，運(yùn)用 可行的提取手段對(duì)原料粉末進(jìn)行提取處理，獲得含目標(biāo)產(chǎn)物的原料液，然后從原料液中盡可能多的提取目標(biāo)產(chǎn)物，提高目標(biāo)產(chǎn)物在物料中的含量，所得物料在 進(jìn)行后續(xù)純化獲得純品。紫杉醇的粗提工藝過程可分為初級(jí)提取和次級(jí)提取，兩個(gè)過 程因所用溶劑不同而除去不同的雜質(zhì)。1紫杉醇的初級(jí)提取工藝初級(jí)提取主要是用甲醇、乙醇、乙酸乙酷一丙酮或二氯乙烷一水對(duì)原料粉末 進(jìn) 行浸提，一般浸提時(shí)間較長。為了縮短浸提時(shí)間，研究人員將超聲、微波和超 臨界流 體萃取等技術(shù)引入到紫杉醇的初級(jí)萃取，極

9、大提高了紫杉醇的萃取效率。1.1溶劑浸 提溶劑浸提常用于紫杉醇的粗提階段，在此階段主要考慮溶劑的選擇。目前用于 浸提紫杉醇的最普通溶劑是甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑。XU和Liu采用的是甲醇-二氯甲烷（95:5, V/V）混合物，浸提時(shí)間為35260min，而Hoke，和Powell，都選 擇的是純甲醇，浸提時(shí)間則為1648h。余廣鰲等通過研究發(fā)現(xiàn)，在浸提過程中，如果使用單一溶劑，則甲醇浸提效果最好。如果使用混合溶劑，要達(dá)到好的浸提 效果，甲醇或乙醇等高極性有機(jī)溶劑不可缺少。鍋田憲助等對(duì)于紫杉醇的提取溶劑種類進(jìn)行了詳細(xì)研究，結(jié)果表明：在乙酸乙酷、乙醛等溶劑中，以乙酸乙醋 一丙酮（1：1混和溶劑的提取效

10、果最好，浸膏中紫杉醇的含量高達(dá)6084%，是甲醇 提取所得浸膏中紫杉醇含量的3倍。也就是說用乙酸乙酷一丙酮（1:1,v/v）一次便 可以使紫杉醇提取量高于以往常用溶劑所能得到的量，為后序的分離純化工作帶來很大的方便。加之乙酸乙酷一丙酮（1：1與甲醇成本相當(dāng)，因此，這一提取方法 的經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性較強(qiáng)。1.2 超聲浸提在中草藥開發(fā)利用中，探索提高有效成分提取率的理論依據(jù)是中草藥現(xiàn)代化研 究的一個(gè)重要方面。目前大多數(shù)是通過實(shí)驗(yàn)方法，根據(jù)影響提取率的因素選取不同的 水平條件來設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化工藝條件，缺少理論上的指導(dǎo)。有人將這些影響因素與有效成分溶出濃度聯(lián)系起來，在 FICk擴(kuò)散定律的基礎(chǔ)上對(duì)常規(guī)提取的

11、動(dòng) 力學(xué)建立了一些數(shù)學(xué)模型。由于超聲場強(qiáng)化中藥有效成分的提取具有降低提取溫度、 縮短時(shí)間和提高提取率等優(yōu)點(diǎn)，日益受到人們的重視。超聲強(qiáng)化提取的湍流效應(yīng)、微擾效應(yīng)、界面效應(yīng)和聚能效應(yīng)與超聲場的頻率、 功率及體系的溫度有關(guān)。頻率越高，溫度越高，這四種效應(yīng)作用越強(qiáng)，達(dá)到提取平衡 時(shí)間越短，平衡時(shí)有效成分含量越高；同時(shí)在中藥有效成分提取時(shí)，要考慮 到有效 成分的穩(wěn)定性，避免在高溫和長時(shí)間條件下有效成分的分解。Auriola等人也將超聲技術(shù)引入紫杉醇的初級(jí)萃取，研究發(fā)現(xiàn)采用超聲技術(shù)，可在低溫下進(jìn)行 操作，這樣可以防止紫杉醇在溫度高時(shí)可能發(fā)生的異構(gòu)化。1.3 超臨界流體萃取超臨界流體萃取過程是利用處于臨界

12、低壓和臨界溫度以上的流體具有特異 增加的溶解能力而發(fā)展出來的化工分離新技術(shù)。利用C02超臨界流體加入甲醇或乙 醇作為夾帶劑，可使紅豆杉樹皮中的大部分紫杉醇得到有效提取，回收率達(dá)85%,選 擇性好，雜質(zhì)少。超臨界流體萃取具有提取能力強(qiáng)、提取率高、萃取時(shí)間短、工藝簡單、操作方 便、產(chǎn)品質(zhì)量好的優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)符合環(huán)保要求，與回歸大自然，崇尚綠色工業(yè)的潮流 一致，具有較大的發(fā)展前景。在紫杉醇的提取過程中，由于減少了含氯有機(jī) 溶劑的使 用從而避免了對(duì)環(huán)境的污染。超臨界流體萃取過程中最常用的溶劑是C02,本身無 毒，在提取產(chǎn)物中無殘留，因而從用要安全角度來講，該技術(shù)應(yīng)用于紫杉醇的提取具 有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。Jen

13、nings用CO?和加入乙醇改性劑的CC?作超臨界萃取溶劑，在 318K的溫度下和15.0725.79MPa的壓力下，進(jìn)行了紫杉醇的提取研究，發(fā)現(xiàn)紅豆 杉樹皮中的大部分紫杉醇都能得到有效的提取，而且對(duì) 紫杉醇的選擇性要比傳統(tǒng)的單純乙醇提取高；Nair等用含15%的丙酮或乙醇的Cd作溶劑，在430101.325kpa, 308K下用超臨界技術(shù)提取紫杉醇也獲得了滿 意的效果；Castor等以紅豆杉枝葉和嫩芽做原料，用超臨界技術(shù)提取紫杉醇時(shí)，先 以純CC2做溶劑，以除去原料中的脂類，然后加入乙醇以調(diào)節(jié)溶劑的極性，使紫杉醇 的產(chǎn)率達(dá)到了 0.04%;Vandana等利用超臨界的20和M0正QH混合物，

14、對(duì)短葉紅 豆杉樹皮中的紫杉醇也做了提取研究，發(fā)現(xiàn)利用超臨界的NO,以乙醇為夾帶劑，可以把樹皮中的大部分紫杉醇提取出來，比以乙醇為夾帶劑的超臨界 CO2萃取更加有效。雖然超臨界流體萃取技術(shù)在紫杉醇的提取中具有收率局、節(jié)省時(shí) 間和有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn)，但該方法對(duì)儀器設(shè)備要求較高，限制了其應(yīng)用。1.4 微波提取微波是一種波長在19001m頻率在300MHz300GHz的電磁波。由于其具有獨(dú) 特的性質(zhì)（似光特性、穿透特性、熱特性及生物效應(yīng)）而已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng) 域。在中草藥有效成分的提取中亦有嘗試和應(yīng)用，但尚未在規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用。微波提 取技術(shù)主要是基于微波的熱特性，其加熱原理是利用微波場中介質(zhì)的偶極子轉(zhuǎn)向

15、極化 與界面極化的時(shí)間與微波頻率吻合的特點(diǎn)，促使介質(zhì)轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷，加劇熱運(yùn)動(dòng)，將 電能轉(zhuǎn)化為熱能。微波輻射導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)尤其是水分子 吸收微波能量而產(chǎn)生 大量的熱量，使細(xì)胞內(nèi)溫度迅速上升，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜沖 破，形成微小的孔洞。進(jìn)一步加熱，細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞壁水 分減少，細(xì)胞收縮，表面出 現(xiàn)裂隙。因此使胞外溶劑容易進(jìn)人胞內(nèi)，溶解并釋放出有效成分。與傳統(tǒng)浸提方法相 比，微波提取具有穿透力強(qiáng)、選擇性高、加熱效率高等顯著特點(diǎn)，而且其操作簡便、 快速、節(jié)能、高效。因此，微波技術(shù)用于中草藥有效成分提取具有巨大潛力。Kasltu 等采用甲醇或乙醇作為提取溶劑，在60c條件下對(duì)紅豆杉植

16、物進(jìn)行提取，所需時(shí)間長達(dá)2448h ,在溶劑系統(tǒng)不變的情況下，采用微波技術(shù)，提取時(shí)間縮短到10min以內(nèi)。2、紫杉醇的次級(jí)提取工藝初級(jí)提取得到的原料液中，紫杉醇的濃度很低，需經(jīng)進(jìn)一步萃取分離以獲得符 合純化標(biāo)準(zhǔn)的紫杉醇浸膏。次級(jí)提取中最為常用的方法為液液萃取，此外還有固相 萃取和膜分離等。2.1 液液萃取液液萃取通常分為非極性溶劑萃取、低極性溶劑萃取和堿液洗滌。對(duì)紅豆杉植 物進(jìn)行浸提后，所獲浸膏通常用非極性或低極性溶劑進(jìn)行分配萃取。通常是用二氯甲 烷一水或三氯甲烷一水對(duì)上述浸膏進(jìn)行分配萃取。這種方法簡單易行，但所得產(chǎn)物雜質(zhì)較多。wall等對(duì)短葉紅豆杉樹皮的乙醇提取物用水和三氯甲烷進(jìn)行 分配 萃

17、取，效果較為理想；W計(jì)herup等對(duì)6種紅豆杉屬植物的針葉和樹皮進(jìn)行了分析， 主要用二氯甲烷和水對(duì)提取物進(jìn)行分配，溶于二氯甲烷的部分用多種溶劑抽提，來進(jìn)行初分離。這種低極性溶劑萃取方法的局限是過程中伴隨紫杉醇的較大損 失，因?yàn)轶w系中含有相當(dāng)量的極性較高的溶劑如甲醇、 乙醇等，在除去的雜 質(zhì)相中仍有大量的紫杉醇，且此方法需反復(fù)多次操作，有機(jī)溶劑消耗量大，易造成污 染環(huán)境。為了改善上述缺點(diǎn)，元英進(jìn)等闊用乙酸乙醋溶解紫杉醇浸膏后，再以堿溶液 進(jìn)行洗滌，除去大量雜質(zhì)的同時(shí)使紫杉醇幾乎全部回收，此方法節(jié)約了溶劑用量，并減少了環(huán)境污染，可用于生產(chǎn)。EP5533780A提出了一種分離紫杉 醇 及其前體的方法

18、，包括真空干燥紫杉屬植物的甲醇萃取物，用環(huán)己烷和二氯甲烷進(jìn) 行溶劑萃取以得到粗紫杉醇，接著進(jìn)行硅膠柱HPLC分離等步驟;w09413827提出了一種純化紫杉醇的方法，包括用乙醇、甲醇和丙酮進(jìn)行有 機(jī)溶劑萃取，用活性炭或 木炭作吸附劑進(jìn)一步處理粗提物，接著用正相色譜法分離。Enakasha等人在分離 紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)物時(shí)采用的次級(jí)萃取劑是氯仿。實(shí)驗(yàn)時(shí)首先將愈傷組織用甲醇萃 取，勻漿化。過濾后將濾液調(diào)整為甲醇含量為65%，加入氯仿(3:1, v/v)，分相， 最終紫杉醇回收率為87%。2.2 固相萃取由于植物中紫杉醉含量很低，且成分復(fù)雜，提取工作困難，液一液萃取操作又常導(dǎo)致回收率低、分離效果差等

19、問題。固相萃取法(Solid PhaseExtraction，SPE)作為一種新型萃取方法，具有節(jié)省時(shí)間、降低溶劑用量、提高選擇性和收 率的 優(yōu)點(diǎn)。SPE實(shí)質(zhì)是色譜分離方法(前沿色譜)，其主要是除去與紫杉醇極性相差較 大的雜質(zhì)。所用填料主要有硅膠、氧化鋁和CIS反相硅膠。固相萃取法所使用的設(shè) 備主要是濾筒，通常的做法是將含有紫杉烷類物質(zhì)的原料加入濾筒，進(jìn)行梯度洗脫。這種方法在完成液一液萃取所能達(dá)到的效果的同時(shí)還能從一定程度上達(dá)到初次色譜分離的效果。陳振德等以紅豆杉科框?qū)僦参?Torreya)的假種皮為原料，直接對(duì)乙醇提取物進(jìn)行硅膠柱層析，降低了制備紫杉醇的成本，擴(kuò)大了其 原料的來源，且保護(hù)了植

20、物資源。Mattina等劉在研究中比較了三種不同的固相萃 取方法。在第一種方法中使用了高效C18萃取柱作為濾筒；第二種方法將C18吸附劑裝入聚丙烯過濾柱制成濾簡；第三種方法中使用的設(shè)備是C18EmP0re濾板和Millipore玻璃過濾儀器。無論使用何種裝置進(jìn)行萃取，洗脫液的順序如下 去離子水:20%的甲醉溶液:45%或50%的甲醇溶液:80%的甲醇溶液。大多數(shù)紫杉 烷類物質(zhì)都選擇性地被80%的甲醇溶液洗脫下來。最后的比較結(jié)果顯示，C18EmPore濾板能極大地提高粗提物的處理量，同時(shí)還能較好地回收極性較低的紫 杉烷類物質(zhì)。韓麗萍等選擇中性氧化鋁進(jìn)行固相萃取，有效的去除了紫杉浸膏和紫杉 口服液

21、制劑中的雜質(zhì)和干擾物，使其中的待測(cè)成份紫杉醇得到了準(zhǔn)確有 效的定量分 析。2.3 膜分離技術(shù)膜分離(Membranes即aration)是利用具有一定選擇性、透過特性的過濾介質(zhì)進(jìn) 行物質(zhì)的分離純化，是人類最早應(yīng)用的分離技術(shù)之一。作為一種有效的分離純化手 段，膜分離被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。它依靠膜兩側(cè)的壓力差，在與溶 液接觸時(shí)，使溶液中分子量小于其截留分子量的溶質(zhì)透過膜，分子量大于截留分子量的溶質(zhì)留在原液內(nèi)，通過對(duì)試樣中物質(zhì)分子量的不同，選擇截留分 子量不同的膜分離設(shè)備達(dá)到對(duì)物料中組分的分離。膜分離法近年來也用于分離紫杉烷類化合物。Carver等采用平板式、中空纖維式和管式膜組件，對(duì)

22、超濾膜和反 滲透膜在紫杉烷類物質(zhì)的分離過程中的應(yīng)用進(jìn)行了研究，其結(jié)果表明：采用膜分離方法可以進(jìn)一步濃縮粗提過程所得浸膏，使紫杉烷類物質(zhì)的濃度提高5倍左右，相當(dāng)于對(duì)浸膏又進(jìn)行了一次預(yù)處理，從而減小了后序色譜分離的負(fù)擔(dān)和 紫杉醇的損失。Raymond等人用0.2m的尼龍膜和PVDF膜處理紫杉醇的組織培養(yǎng) 液時(shí)，發(fā)現(xiàn)尼龍膜可以選擇性地截留紫杉烷類物質(zhì)。尼龍膜截留了幾乎所有的10-去乙猷基紫杉醇、紫杉醇以及絕大部分的Cephal o mannine，而對(duì)其它的 紫 杉烷類幾乎沒有截留作用，而PVDF膜則截留了所有的紫杉烷類，這說明尼龍膜可 以選擇性地吸附紫杉烷類化合物。2.4 樹脂吸附分離法樹脂吸附分

23、離法（ResiouSAdsorpti。nSeparati o nMethod，RASM）基于 離子 交換分離原理。離子交換分離的原理是利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié) 合力的差異進(jìn)行物質(zhì)分離的技術(shù)。最常用的離子交換劑是離子交換樹脂，它是由不溶 性的載體、功能團(tuán)和平衡離子（也稱活性離子）組成的。紫杉醇是一種二菇類化合物，具有多環(huán)結(jié)構(gòu)，容易被帶苯環(huán)的吸附劑特異性吸附，所以近年 聚苯乙烯型樹脂被較多的應(yīng)用到紫杉醇的前處理中，可有效的去除色素等雜質(zhì)。元英 進(jìn)等的研究結(jié)果表明，聚苯乙烯型強(qiáng)堿樹脂（Ps-A）及多乙烯多胺一環(huán)氧 氯丙烷縮 聚型弱堿樹脂（PC-A）對(duì)二氯甲烷粗提物的吸附及脫色性能較好

24、，有望用于紫杉醇 的純化分離。張志強(qiáng)等采用聚苯乙烯型大孔樹脂（201 x4層析，有效地從紅豆杉甲醇浸膏中分離紫杉醇和脫除色素，樣品中紫杉醇含量從0.65%提高到 了 2.15%，回收率達(dá) 99.6%。以上各種方法得到的是低純度的紫杉醇浸膏，實(shí)際上是紫杉烷類化合物如菇類 化合物、類脂、葉綠素和酚類同時(shí)伴隨有目標(biāo)產(chǎn)物紫杉醇，要得到藥用的紫杉醇， 還需進(jìn)一步純化和精制。3、紫杉醇的純化工藝經(jīng)過粗提獲得的浸膏中紫杉醇的含量很低，要獲得達(dá)到醫(yī)用純度的紫杉醇還需 對(duì)粗提物進(jìn)一步純化處理。紫杉醇的純化工藝是獲得高純紫杉醇的關(guān)鍵步驟，這一步 驟涉及的工藝占主導(dǎo)地位的是色譜方法。用色譜法分離純化紫杉醇時(shí)，柱色譜

25、被用于紫杉醇的預(yù)分離和最終分離，而薄層色譜則被用于紫杉醇的檢測(cè)和純 化。目前，隨著分離工藝的不斷完善，色譜法有了長足進(jìn)步。各種用于紫杉醇分離純化的 色譜方法有高效液相色譜（HPLC），薄層色譜（TLC），超臨界流體色譜（SFC）、電泳色譜（MEKC）、免疫親和色譜、高效逆流色譜（HSCCC）等。下面 簡單介紹幾種常用的紫杉醇純化方法。3.1 正相色譜法正相色譜是紫杉醇分離純化過程中普遍采用的方法，在早期分離純化的研究 中占有主導(dǎo)地位，至今仍在廣泛使用。正相色譜一般是使用硅膠作固定相，使用一 些極性較小的有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，將紫杉烷類化合物洗脫出來。正相色譜的突 出優(yōu)點(diǎn)是固定相價(jià)格低廉，用普通的硅

26、膠即可，而且洗脫用的流動(dòng)相多為揮發(fā)性很強(qiáng) 的有機(jī)溶劑，溶劑回收簡單。陳建民等以50 300目硅膠做固定相，在常壓下梯 度洗脫含1648%的紫杉醇粗品，用無毒性的正構(gòu)烷煌、乙酷為洗脫劑，常壓下分離 純化紫杉醇，洗脫所得儲(chǔ)分經(jīng)真空冷凍干燥，得到99十99.5%的紫杉醇。該方法工藝簡單，成本低，洗脫劑容易回收，但紫杉醇回收率較低;呂秀陽等將樣品進(jìn)行浸提和液液萃取后，使用了三次正相色譜分離，在三次柱層析的過程 中，采用的空白硅膠目數(shù)增加，空白硅膠與拌樣硅膠之比增大，而流動(dòng)相的 極性下 降，最后結(jié)晶得到紫杉醇含量62.5%的白色棉花狀結(jié)晶。3.2 反相色譜法由于正相色譜所使用的固定相大多為硅膠，而硅膠的

27、不可逆吸附使樣品損失增 大，并且硅膠固定相只能使用一次，操作十分不便，因而反相色譜的使用越來越廣 泛。一般情況下，反相色譜使用極性較大的有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相， 先將一些 雜質(zhì)及色素洗脫下來，然后再增大梯度將紫杉烷類化合物洗脫出來。雛麗娜等以東北紅豆杉樹葉為原料，采用正相色譜和反相色譜法分離提純了紫杉醇和三尖杉寧堿，反相色譜中使用了一種新穎的高分子填料。東北紅豆杉枝 葉經(jīng) 過一次正相色譜分離后，再經(jīng)兩次反相色譜分離，分離得到兩種白色針狀固體。經(jīng)1H NMR和13C NMR測(cè)試表明，兩種物質(zhì)分別為紫杉醇和三尖杉寧堿,純 度達(dá)到98%以上，回收率大于70%;張志強(qiáng)等選擇了廉價(jià)的大顆粒烷基硅膠層析 柱純

28、化紫杉 醇粗品，并對(duì)層析操作條件進(jìn)行了優(yōu)化，使紫杉醇的含量提高到98%，回收率在85%以上，并且采用該固定相可以降低紫杉醇的生產(chǎn)成本和提高回收率;Zamir等人在分離加拿大紅豆杉的根和樹皮時(shí)，使用了重結(jié)晶技術(shù)和反向色譜技術(shù)相結(jié)合的方法。他們首先利用重結(jié)晶技術(shù)從粗提物中分離出了10-DAB和9-dihydro-13- acetyl-baCCat in III ,再用反相高效液相色譜分離其他紫杉烷類物質(zhì)，從而避免了在分離純化階段多次使用色譜柱，。雖然目前反相色譜分離純化紫杉 醇的工藝尚沒有工業(yè)化的報(bào)道，但相對(duì)于正相色譜工藝，反相色譜有很多優(yōu) 點(diǎn)。首 先，它不消耗大量的有機(jī)溶劑，對(duì)環(huán)境污染較?。黄浯?/p>

29、，人們?cè)陂_發(fā)反相填料時(shí)專門引人的一些特定的鍵合相使反相填料有更好的選擇性，在克服正相硅 膠的不可逆吸附造成目標(biāo)產(chǎn)物回收率低方面也很有價(jià)值。3.3 薄層色譜法薄層色譜（TLC）是分離紫杉醇的常用方法。一般先把提取液濃縮，然后在TLC硅膠板上平行點(diǎn)樣，用丙酮、氯仿、甲醇、庚烷、乙酸、二氯甲烷、乙酸乙醋等 展開，再進(jìn)行紫杉醇的定位。定位的方法有：與標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行對(duì)照，在254nm紫外燈 下進(jìn)行定位標(biāo)記，刮下每一部位，裝入小柱。用甲醇洗脫，將洗脫液蒸干，從而使紫 杉醇得到分離。薄層色譜技術(shù)早期多用于紫杉烷類化合物的定性及半定量分析。TLC 結(jié)合核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）技術(shù)，己成功地分離獲得多種新的紫杉烷類化 合物，顯示出在定性分析方面的優(yōu)勢(shì)。Matysik等報(bào)道了一種分步梯度TLC結(jié)合光密度掃描定量測(cè)定紫杉醇的方法， 該方法采用混合溶劑兩步梯度展開，亦獲得滿意結(jié)果；由Stasko等人開發(fā)的多維薄 層色譜法（MTLC）使TLC法獲得了極大的發(fā)展。該項(xiàng)研究采用了三種薄層 板:氟基 板，二苯基板和氨基板，分別進(jìn)行正相和兩維洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)氟基板和二苯基板能有 效分離紫杉醇和Cephalomafinine，而氨基板效果較差。雖然此項(xiàng)研究卻