含生物堿類成分中藥制劑的分析

1、第五章第五章 中藥制劑中各類化學(xué)成分分析中藥制劑中各類化學(xué)成分分析各類化學(xué)成分的理化性質(zhì)各類化學(xué)成分的理化性質(zhì)各類成分各類成分供試液的提取純化制備方法供試液的提取純化制備方法各類成分定性鑒別的原理方法各類成分定性鑒別的原理方法各類成分各類成分定量測定的原理和方法定量測定的原理和方法 第一節(jié) 生物堿alkaloid類成分分析 了解生物堿的理化性質(zhì)熟悉中藥制劑內(nèi)Alk定性鑒別的原理方法掌握Alk的供試液的提取純化制備方法、定量測定的原理和方法 一、概述（了解）生物堿是中藥中重要的有效成分之一。生物堿是中藥中重要的有效成分之一。多具復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，有顯著的生理作用。多具復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，有顯著的生理作

2、用。至少有豆科、防已科、毛茛科、夾竹桃科、茄至少有豆科、防已科、毛茛科、夾竹桃科、茄科、石蒜科科、石蒜科50多科，多科，120屬以上植物中有生物堿屬以上植物中有生物堿存在。存在。以雙子葉植物最多，其次單子葉植物，裸子植以雙子葉植物最多，其次單子葉植物，裸子植物。物。以罌粟科等的植物分布較多。以罌粟科等的植物分布較多。生物堿的種類很多生物堿的種類很多(見表見表1)，但具生理活性大多，但具生理活性大多集中在異喹啉、吲哚、茛菪烷類等衍生物。集中在異喹啉、吲哚、茛菪烷類等衍生物。多以鹽的形式存在于植物體內(nèi)。序號(hào)類型基本結(jié)構(gòu)植物藥舉例1、 吡咯類a古豆、狗舌草2、 吡啶類b毒芹、一葉秋、煙草3、 喹啉類

3、c 多雞納4、 異喹啉類d黃連、罌粟、吐根、石蒜5、 吲哚類e 番木鱉、毒扁豆、蘿芙木6、 咪唑類f毛果蕓香生物堿類型及其基本結(jié)構(gòu) 生物堿類型及其基本結(jié)構(gòu)生物堿類型及其基本結(jié)構(gòu)6咪唑類f毛果蕓香7喹唑酮類g 常山8嘌啉類h茶葉9甾體類j 澳洲茄10莨菪烷類k顛茄、洋金花、古柯11無環(huán)類 麻黃12其他 烏頭、秋水仙生物堿類型及其基本結(jié)構(gòu)生物堿類型及其基本結(jié)構(gòu)NNHNNNHNHN a b c d e f NHNONNNNHOHRCH3N g I j K 與中藥化學(xué)差別 (1)用量不同：分析一般樣品量小。 (2)提取的原則不同：分析是保證待測組分的最大回收。 (3)分離目的不同：分析是盡量排除干擾，

4、凈化待測組分。 (4)定性目的不同 二、理化性質(zhì)與提取分離1、物理性質(zhì)一般無色結(jié)晶固體，少數(shù)為非結(jié)晶形粉未，少數(shù)有色。2、旋光性多具手性碳原子，所以多具有旋光性，且多為左旋。二、理化性質(zhì)與提取分離3、酸堿性：分子中含N原子，多具有堿性。 堿性： 胍季銨堿烷胺類(脂叔胺堿)吡啶(芳叔胺堿)酰胺類。 Sp3Sp2Sp1 4、溶解性 游離生物堿：極性較小，不溶或難溶于水 能溶于乙醇、氯仿、丙酮、乙醚等有機(jī)溶媒中 分析中常用氯仿、乙醚作為提取溶劑 生物堿的鹽類：大多易溶于水及醇 不溶于或難溶于苯、氯仿、乙醇等 該性質(zhì)是相反的，可用來提取、分離、精制生物堿 但需注意：季胺堿、酰胺堿、和一些含極性基團(tuán)較多

5、的AlkAlk則能溶于水 含酚羥基、和羧基的生物堿呈酸堿兩性反應(yīng) 二、理化性質(zhì)與提取分離二、理化性質(zhì)與提取分離5、沉淀反應(yīng)lAlk在H水液或H稀醇(50）中，與Alk試劑生成難溶性 精制協(xié)助鑒定l但蛋白質(zhì)、肽類、鞣質(zhì)、嘌呤類，有的黃酮、香豆素及查耳酮也可與某些Alk試劑反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中需排除這些干擾。l含Alk樣品液純化精制后，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 二、理化性質(zhì)與提取分離水提溶液）樣品酸性提取液（3 CHClH OH 堿化，正丁醇萃?。┨崛∫海景穳A采用NaOHCHCl3 液（或正丁醇液）3 CHCl水洗 生物堿陰性，一般不含無沉淀：陽性，可能有生物堿產(chǎn)生沉淀： H 酸性水液 Alk沉淀試劑(3種) 生物

6、堿沉淀沉淀試劑大體可分為三類 (1)與Alk生成不溶性鹽類如：磷鉬酸、硅鎢酸(Alkertrand)、磷鎢酸； (2)與Alk形成疏松的絡(luò)鹽如：碘碘化鉀試劑(Wagner)； (3)與Alk的氮原子反應(yīng)，生成不溶性加成物如：碘化鉍鉀(Dragendorff)、碘化汞鉀試劑(Mayer)。 二、理化性質(zhì)與提取分離 6、顯色反應(yīng)有些Alk與某些試劑呈顏色反應(yīng)，可借以識(shí)別Alk，但易雜質(zhì)干擾，需凈化后進(jìn)行。 7、生物堿供試液的提取 主根據(jù)Alk的溶解度而定。 (1)有機(jī)溶劑提取氨水濕潤Alk游離，后用CHCl3、(CH3CH2)2O提取較穩(wěn)定的生物堿鹽類，可用堿性較強(qiáng)的NaCO3、Ca(OH)、Na

7、OH堿化本法缺點(diǎn)是不能提出水溶性生物堿 二、理化性質(zhì)與提取分離 (2)醇水溶媒提取 用中性甲醇、乙醇、酸性甲醇、乙醇、酸水(如：0.11%)鹽酸、硫酸、酒石酸等提取。 此法較簡便，但提取出的雜質(zhì)較多，需進(jìn)一步純化處理。 (3)混合溶媒提取用不同極性的溶劑按不同比列混合，該法可以較好地提取出待測組分。如 ： 百 部 、 粉 防 已 用 乙 醚 : 氯 仿 : 乙醇:10%NH3OH(25：8：25：1)。 二、理化性質(zhì)與提取分離二、理化性質(zhì)與提取分離(4) 水溶性Alk：可用Alk沉淀試劑如雷氏鹽(硫氰化鉻銨)、磷鎢酸等生成不溶性的復(fù)鹽而從水中析出, ,沉淀溶于丙酮，通過陽離子交換樹脂，氫氧化銨

8、洗脫，可得游離生物堿(5)生物堿樣品的提取方法 常用的有：冷浸法、滲漉法、超聲提取法、索氏提取法、熱回流提取法等 冷浸法與冷浸超聲提取法操作簡便、快捷，常用 必要時(shí)，要對上述方法作比較，以優(yōu)選出最佳提取方法。 8、生物堿樣品預(yù)處理精制 (1)萃取法酸堿萃取法經(jīng)典法 Alk離子對萃取法，依據(jù)離子對萃取原理 生物堿在弱酸性介質(zhì)陽離子+ +大分子(離子對試劑) 復(fù)鹽（水溶性小，溶于有機(jī)溶劑） 與水溶性雜質(zhì)分離若離子對試劑為有機(jī)染料，則該法還可用于生物堿的定量分析，如：小蘗堿可加入pH8.5pH8.5的四溴酚酞乙酯緩沖液，CHCH2 2ClCl2 2萃取，取CHCH2 2ClCl2 2液比色測定。 (

9、2)(2)色譜法柱色譜、色譜小柱二、理化性質(zhì)與提取分離三、定性鑒別（一）一般理化鑒別 常用鑒別有：Alk的沉淀反應(yīng)、特殊顯色反應(yīng)、色譜鑒別等l、Alk的沉淀反應(yīng)三種以上試劑呈陽性反應(yīng)。注意干擾2 2、特殊顯色反應(yīng)(1)(1)對二甲氨基苯甲醛試劑吲哚類顯藍(lán)(2)(2)小蘗堿鹽酸過氧化氫試劑，呈紅紫(3)Vitali(3)Vitali醇制KOHKOH試劑，莨菪烷類呈紫(4)Labat(4)Labat反應(yīng)次亞甲二氧基反應(yīng)(5)(5)雙縮脲反應(yīng)麻黃堿呈紫色 （二）色譜鑒別方法：TLC、PC、HPLC、GC等。多用TLC法。 中藥名吸附劑展開劑顯色方法黃連、黃柏(小蘗堿)硅膠G 正丁醇:醋酸:水(7:2

10、:1)氯仿:甲醇(4:1)改良碘化鉍鉀試劑或紫外燈365nm麻黃(麻黃堿)硅膠G氯仿：甲醇：濃氨水(20：5：0.5)正丁醇：醋酸：水(4：1：1滴)0.5%茚三酮試劑元胡(延胡索乙素)硅膠G或乙醚：環(huán)已烷：甲醇(5：3：0.5) 硅膠H:已烷:氯仿:甲醇:二已烷(5:3:0.5:l)改良碘化鉍鉀試劑烏頭(烏頭堿)堿性氧化鋁乙醚：石油醚(10:1碘蒸氣l早期常用的有：酸堿滴定法、沉淀法、酸性染料比色法、雷氏鹽比色法等l 現(xiàn)用：分光光度法、TLC、HPLC、GC等（一）總生物堿含量測定1、經(jīng)典化學(xué)法(重量法、容量法)(1)重量法l原理：Alk可與生物堿沉淀試劑定量反應(yīng)生成沉淀，根據(jù)沉淀量可間接求

11、出生物堿含量。此法操作較繁，費(fèi)時(shí)、且準(zhǔn)確度較差四、含量測定方法四、含量測定方法 適用范圍：凡堿性很弱多不宜用容量法或其他方法測定者揮發(fā)性生物堿不宜用此法 例 苦參總堿測定：硅鎢酸沉淀法苦參片20%NaOH20%NaOH堿化氯仿回流提取稀鹽酸溶解定容10%10%硅鎢酸沉淀 過濾沉淀沉淀干燥稱重，計(jì)算含量(2)容量法l分類：酸堿滴定、兩相滴定、絡(luò)合滴定、沉淀容量法等 I、酸堿滴定原理l生物堿呈堿性，可用酸滴定；pH指示劑指示終點(diǎn)。l生物堿鹽，一般呈酸性(強(qiáng)酸弱堿鹽)，可用強(qiáng)堿滴定。l因其終點(diǎn)在70-90%乙醇中比在水中明顯，故可用標(biāo)準(zhǔn)堿的醇溶液滴定，以酚酞為指示劑指示終點(diǎn)四、含量測定方法四、含量測

12、定方法II、兩相滴定原理BHInInBH1離子 離子 分子 在水相與水不相溶的有機(jī)溶劑(氯仿應(yīng)用最多)兩相中進(jìn)行滴定注意選擇：合適的PH，合適的酸性染料，合適的有機(jī)溶劑，以PH最為重要。四、含量測定方法 a a、兩相酸堿滴定法：生物堿鹽溶于水，加適量氯仿等有機(jī)溶劑，NaOH滴定，酚酞指示劑指示終點(diǎn)。滴定產(chǎn)生游離生物堿轉(zhuǎn)溶有機(jī)溶劑，所以靈敏度比一般酸堿滴定好，又稱為兩相置換滴定b b、兩相酸性染料滴定法： 用酸性染料為滴定劑，在水與氯仿兩相中滴定生物堿，Alk陽離子與酸性染料陰離子締合進(jìn)入氯仿（等有機(jī)溶劑），終點(diǎn)時(shí)，稍過量酸性染料使水層產(chǎn)生顏色指示終點(diǎn)。利用氯仿層可比色定量。 四、含量測定方法I

13、II、絡(luò)合滴定原理用過量的重金屬生物堿沉淀試劑，使生物堿沉淀，將沉淀溶解，然后用絡(luò)合劑滴定沉淀中重金屬先用過量重金屬生物堿沉淀試劑，使生物堿沉淀，后用絡(luò)合劑滴定溶液中剩余的過量重金屬生物堿沉淀試劑，而間接定量。繁瑣少用、沉淀容量法利用生物堿與生物堿沉淀試劑的反應(yīng)，直接或間接定量2、光譜法定量（1）直接測定（2 2）比色法（可見分光光度法）酸性染料比色法、雷氏鹽比色法、苦味酸比色法 I 、酸性染料比色法 原理：與酸性染料滴定法相同 本法關(guān)鍵：pHpH值、酸性染料種類、有機(jī)溶劑 常用染料：甲基橙、溴麝香草酚藍(lán)BTBBTB、溴甲酚綠、溴酚藍(lán)、溴甲酚紫等 有機(jī)溶劑選擇：依據(jù)離子對與有機(jī)相能否形成氫鍵以

14、及形成氫鍵能力的強(qiáng)弱 常用有機(jī)溶劑：氯仿、二氯甲烷 注意：微量水份可使有機(jī)相混濁，影響比色，應(yīng)先脫水后測定（2）比色法（可見分光光度法）II 、雷氏鹽比色法 原理：Alk與雷氏鹽生成紅色沉淀，此沉淀溶于丙酮，于520-526nm波長處，選擇最大吸收波長，測定吸收度。根據(jù)雷氏鹽丙酮液的為106.5(單鹽)或203.0(雙鹽)。按下式計(jì)算樣品生成雷氏鹽重量（W，g）。1000VMAW（2）比色法（可見分光光度法）IV、其它比色法苦味酸比色法方法：沉淀加堿解離，以有機(jī)溶劑提出生物堿，將苦味酸的堿性水溶液進(jìn)行比色氯仿提取苦味酸生物堿鹽，堿性緩沖液使鹽解離，并將苦味酸提取而進(jìn)行比色氯仿提取苦味酸鹽而直接

15、進(jìn)行比色。（2）比色法（可見分光光度法）、異羥肟酸鐵比色法酯鍵結(jié)構(gòu)堿性加熱水解羧基+羥胺異羥肟酸+Fe3+異羥肟酸鐵（紫紅色化合物）如：烏頭總生物堿的測定 主要有HPLC、GC、TLC等 1、TLC法 對樣品純化程度要求不高。但一般點(diǎn)樣誤差大，定量時(shí)，首先作一標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察線性范圍，確定定量方法(內(nèi)標(biāo)/外標(biāo)、一點(diǎn)法/二點(diǎn)法)，均需同板標(biāo)準(zhǔn)品隨行對照。同時(shí)要考察方法的穩(wěn)定性、同板與異板的精密度 （二）單體生物堿的含量測定2、HPLC法生物堿鹽為離子型化合物.有離子交換、離子對、正相HPLC法。生物堿為分子型化合物，可用反相、分配HPLC法，應(yīng)用較多。注意：在Alk分析中，反相柱硅膠表面仍殘留有游

16、離的硅醇羥基，呈弱酸性，會(huì)吸附堿性的生物堿使色譜峰拖尾 克服措施： I、固定相 通常硅醇羥基被覆蓋率越高，分離效果越好。如用C8比C18好。 2、HPLC法II、流動(dòng)相 為減小ALK在反相柱上的拖尾，可采取如下措施： a、加入有機(jī)胺類： 常加入三乙胺或季胺堿鹽。 使流動(dòng)相呈堿性，抑制或掩蔽游離硅醇羥基影響。 b、在流動(dòng)相中加入離子對試劑： 與ALK類成分生成離子對掩蔽其堿性基使之不能與固定相表面的硅醇基作用，使ALK類成分易于出峰，且峰形好。 c、增加流動(dòng)相的脂溶性 d、調(diào)整流動(dòng)相的pH值III、柱溫 升高柱溫、樣品液的制備 是定量分析工作是否成功的關(guān)鍵 兩大類：溶劑萃取法、色譜分離法2、HP

17、LC法3 3、 GCGC法：適于有揮發(fā)性，遇熱不分解的生物堿類 如麻黃堿、苦參堿和顛茄類生物堿 例：潔爾陰洗劑中苦參堿的測定4、其他測定方法（二）單體生物堿的含量測定五、應(yīng)用實(shí)例1、含小檗堿的中藥制劑分析 (1) 萬氏牛黃清心丸 TLC法鑒別鹽酸小檗堿UVUV法/ /一階導(dǎo)數(shù)光譜法測定鹽酸小檗堿 (2) 安宮牛黃丸 HPLC法測定鹽酸小檗堿 (3) 香連丸 HPLC法 五、應(yīng)用實(shí)例2、含麻黃堿的中藥制劑分析 麻黃堿性質(zhì)： 揮發(fā)性 堿性較強(qiáng) 可與大多數(shù)生物堿沉淀試劑發(fā)生反應(yīng) 可與金屬離子Cu2+、Ni2+、Co2+在CS2堿性條件形成棕或黃色沉淀，溶解在苯-丙酮（1：1）溶液中定性鑒別含量測定。

18、五、應(yīng)用實(shí)例實(shí)例：1）復(fù)方川貝精片 化學(xué)和薄層色譜鑒別2）疏風(fēng)定痛丸 TLCTLC法鑒別 GC法測定含量3）止咳化痰丸 HPLC法測定含量4）小兒止咳糖漿 UV比色法測定含量五、應(yīng)用實(shí)例3、含延胡索乙素的中藥制劑分析1）安胃片 UV比色法鑒別 UV比色法測定含量2）腸胃寧片 TLCSTLCS法測定含量 3）沉香舒氣丸 TLCSTLCS法測定含量 五、應(yīng)用實(shí)例4、含烏頭堿的中藥制劑分析1 1）酸堿滴定/ /二階導(dǎo)數(shù)光譜法測定小活絡(luò)丸中烏頭堿烏頭15g15g研細(xì)無水乙醇過夜提取濃縮加2%2%鹽酸20ml20ml乙醚萃取酸液乙醚：氯仿(3:1)(3:1)提取3 3次低溫蒸干混合溶液再蒸干無水乙醇5m

19、l5ml溶解 2）HPLC法測定蒙藥那如-3-3丸中烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿五、應(yīng)用實(shí)例3 3）酸性染料比色法：參附注射液中烏頭總堿 改 良 異 羥 肟 酸 鐵 比 色 法 ： 參 附 注 射 液 1 0 m l 1 0 m l 加0.1mol/L HCl 20ml0.1mol/L HCl 20ml乙醚萃取5 5次？酸水pH9-pH9-1010乙醚萃取5 5次？合并無水硫酸鈉過濾？乙醚洗二次？合并醚液除溶劑？無水乙醇定容至10ml10ml。 第一節(jié) 生物堿alkaloid類成分分析 了解生物堿的理化性質(zhì)熟悉中藥制劑內(nèi)Alk定性鑒別的原理方法掌握Alk的供試液的提取純化制備方法、定量測定的原理和方法 第一節(jié) 生物堿alkaloid類成分分析 了解生物堿的理化性質(zhì)熟悉中藥制