基因芯片技術(shù)在環(huán)境微生物群落研究中的應(yīng)用

1、基因芯片技術(shù)在環(huán)境微生物群落研基因芯片技術(shù)在環(huán)境微生物群落研究中的應(yīng)用究中的應(yīng)用摘要摘要 本文按照基因芯片探針的設(shè)計方法本文按照基因芯片探針的設(shè)計方法, , 將環(huán)境樣品群落研究基因芯片分為系統(tǒng)將環(huán)境樣品群落研究基因芯片分為系統(tǒng)寡核苷酸芯片、功能基因芯片、群落基因組芯片、宏基因組芯片寡核苷酸芯片、功能基因芯片、群落基因組芯片、宏基因組芯片, , 并簡要綜并簡要綜述了該技術(shù)在活性污泥、土壤、水等環(huán)境樣品微生物群落研究上的應(yīng)用。述了該技術(shù)在活性污泥、土壤、水等環(huán)境樣品微生物群落研究上的應(yīng)用。 最后最后, , 本文展望了該技術(shù)的研究方向和在尋找不同環(huán)境微生物群落之間差本文展望了該技術(shù)的研究方向和在尋找

2、不同環(huán)境微生物群落之間差異微生物、差異基因或差異表達(dá)基因研究中的應(yīng)用前景。異微生物、差異基因或差異表達(dá)基因研究中的應(yīng)用前景?；蛐酒蛐酒?基因芯片基因芯片, , 又稱又稱DNA DNA 微探針陣列微探針陣列(microarray),(microarray),是一種最重要的生物芯片。是一種最重要的生物芯片。 它的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法是一致的它的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法是一致的, , 都是應(yīng)用已知核酸序都是應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交, , 通過隨后的信號檢測進(jìn)行定性與通過隨后的信號檢測進(jìn)行定性與定量分析。定量分析。 基

3、因芯片在一微小的基片基因芯片在一微小的基片( (硅片、玻片、塑料片等硅片、玻片、塑料片等) )表面集成了大量的分子表面集成了大量的分子識別探針識別探針, , 能夠一次分析大量的基因能夠一次分析大量的基因, , 進(jìn)行大信息量的篩選與檢測。進(jìn)行大信息量的篩選與檢測。環(huán)境樣品及其環(huán)境微生物群落研究環(huán)境樣品及其環(huán)境微生物群落研究環(huán)境樣品包括活性污泥、土壤、水、環(huán)境樣品包括活性污泥、土壤、水、煙、氣溶膠、淤泥、海洋沉積物等。煙、氣溶膠、淤泥、海洋沉積物等。而環(huán)境微生物群落研究包括環(huán)境樣而環(huán)境微生物群落研究包括環(huán)境樣品的微生物分布、種類、功能、動品的微生物分布、種類、功能、動力學(xué)變化及氣候、環(huán)境污染等環(huán)境

4、力學(xué)變化及氣候、環(huán)境污染等環(huán)境因素改變對其微生物生態(tài)的影響等。因素改變對其微生物生態(tài)的影響等。環(huán)境樣品群落研究基因芯片的種類環(huán)境樣品群落研究基因芯片的種類鑒于環(huán)境樣品的特點鑒于環(huán)境樣品的特點, , 不是所有種類的基因芯片不是所有種類的基因芯片都適于環(huán)境微生物群落研究。都適于環(huán)境微生物群落研究。按照基因芯片探針的設(shè)計方法按照基因芯片探針的設(shè)計方法, , 用于環(huán)境樣品群用于環(huán)境樣品群落研究的基因芯片主要有：系統(tǒng)寡核苷酸芯片、落研究的基因芯片主要有：系統(tǒng)寡核苷酸芯片、功能基因芯片、群落基因組芯片、宏基因組芯片功能基因芯片、群落基因組芯片、宏基因組芯片系統(tǒng)寡核苷酸芯片系統(tǒng)寡核苷酸芯片 系統(tǒng)寡核苷酸芯片

5、建立在系統(tǒng)標(biāo)記基因如系統(tǒng)寡核苷酸芯片建立在系統(tǒng)標(biāo)記基因如rRNA rRNA 基礎(chǔ)之上?；A(chǔ)之上。rRNA rRNA 是研究細(xì)菌進(jìn)化和親源關(guān)系的是研究細(xì)菌進(jìn)化和親源關(guān)系的重要指標(biāo)重要指標(biāo), , 是細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)最有用和常用的是細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)最有用和常用的分子鐘。分子鐘。16S rRNA16S rRNA是最常用的作為細(xì)菌群落結(jié)是最常用的作為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子。構(gòu)分析的系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記分子。 它由多個高度保守的區(qū)段和可變區(qū)段組成它由多個高度保守的區(qū)段和可變區(qū)段組成, ,保守保守性序列基本保守性序列基本保守, , 反映生物物種的親緣關(guān)系反映生物物種的親緣關(guān)系, ,因因此可以利用恒定區(qū)序列設(shè)

6、計引物將此可以利用恒定區(qū)序列設(shè)計引物將16S rRNA 16S rRNA 片片段擴(kuò)增出來段擴(kuò)增出來; ; 高變性則揭示生物物種的特征核高變性則揭示生物物種的特征核酸序列酸序列, , 其序列因不同細(xì)菌而異其序列因不同細(xì)菌而異, , 因此可利用因此可利用可變區(qū)序列的差異來設(shè)計不同菌屬、菌種的探可變區(qū)序列的差異來設(shè)計不同菌屬、菌種的探針。針。 由于由于16SrDNA 16SrDNA 序列在原核生物中的高度保守性序列在原核生物中的高度保守性, , 對于近緣種或同一種內(nèi)的不對于近緣種或同一種內(nèi)的不同菌株之間的鑒別分辯力較差同菌株之間的鑒別分辯力較差, ,因此只適于研究屬及屬以上水平的菌株。因此只適于研究

7、屬及屬以上水平的菌株。 系統(tǒng)寡核苷酸芯片是目前應(yīng)用最廣的一種基因芯片系統(tǒng)寡核苷酸芯片是目前應(yīng)用最廣的一種基因芯片, , 利用該技術(shù)已經(jīng)成功對利用該技術(shù)已經(jīng)成功對堆肥、土壤、活性污泥、鈾污染含水土層等環(huán)境樣品進(jìn)行了微生物檢測、菌堆肥、土壤、活性污泥、鈾污染含水土層等環(huán)境樣品進(jìn)行了微生物檢測、菌群動力學(xué)、多樣性和結(jié)構(gòu)分析。群動力學(xué)、多樣性和結(jié)構(gòu)分析。功能基因芯片（功能基因芯片（FGAFGA） 功能基因芯片通常建立在催化生化反應(yīng)的關(guān)鍵功能基因芯片通常建立在催化生化反應(yīng)的關(guān)鍵功能基因之上功能基因之上, , 這些基因包括了那些與研究對這些基因包括了那些與研究對象有確定關(guān)系的基因象有確定關(guān)系的基因, ,

8、或至少是與研究對象的或至少是與研究對象的關(guān)系有待考證的基因。關(guān)系有待考證的基因。 作為作為 FGA FGA 候選基因應(yīng)該具有的特點：候選基因應(yīng)該具有的特點：(1)(1)該基該基因是參與生化過程的關(guān)鍵酶或蛋白質(zhì)編碼基因因是參與生化過程的關(guān)鍵酶或蛋白質(zhì)編碼基因; ; (2)(2) 進(jìn)化保守但在不同微生物之間具有足夠的變異進(jìn)化保守但在不同微生物之間具有足夠的變異, , 從而可以對不同菌株設(shè)計探針從而可以對不同菌株設(shè)計探針; (3); (3)不同的基因不同的基因在數(shù)據(jù)庫的序列信息量是不同的在數(shù)據(jù)庫的序列信息量是不同的, , 應(yīng)該選擇在應(yīng)該選擇在公共數(shù)據(jù)庫中具有翔實序列信息的有關(guān)基因。公共數(shù)據(jù)庫中具有翔

9、實序列信息的有關(guān)基因。 根據(jù)根據(jù) FGA FGA 的目的及其雜交靶標(biāo)的種類的目的及其雜交靶標(biāo)的種類, FGA , FGA 分為功能分類基因芯片和基因表分為功能分類基因芯片和基因表達(dá)芯片。達(dá)芯片。 前者的目的主要是研究菌群是否具有這些特定反應(yīng)過程及其功能的分布、變化、前者的目的主要是研究菌群是否具有這些特定反應(yīng)過程及其功能的分布、變化、多樣性多樣性, , 其雜交靶標(biāo)是菌群其雜交靶標(biāo)是菌群DNADNA的的PCR PCR 產(chǎn)物。產(chǎn)物。 而后者用于研究這些特定功能基因的生理活性及其基因表達(dá)情況而后者用于研究這些特定功能基因的生理活性及其基因表達(dá)情況, , 需提取環(huán)境需提取環(huán)境樣品的樣品的mRNA, m

10、RNA, 其雜交靶標(biāo)是菌群其雜交靶標(biāo)是菌群cDNA cDNA 的的PCR PCR 產(chǎn)物。產(chǎn)物。 FGA FGA 的探針主要是功能基因的的探針主要是功能基因的PCR PCR 產(chǎn)物或合成的寡核苷酸產(chǎn)物或合成的寡核苷酸, , 其中其中, , 前者通前者通過對某些微生物功能基因保守序列設(shè)計引物過對某些微生物功能基因保守序列設(shè)計引物, , 從而擴(kuò)增出相關(guān)基因從而擴(kuò)增出相關(guān)基因; ; 而后而后者是通過數(shù)據(jù)庫中的序列信息直接設(shè)計的。者是通過數(shù)據(jù)庫中的序列信息直接設(shè)計的。 目前目前, FGA , FGA 應(yīng)用推廣的限制性瓶頸在于功能基因數(shù)據(jù)庫的不完整性和某些應(yīng)用推廣的限制性瓶頸在于功能基因數(shù)據(jù)庫的不完整性和某

11、些微生物的不易培養(yǎng)性。微生物的不易培養(yǎng)性。群落基因組芯片群落基因組芯片(CGA)(CGA) 群落基因組芯片群落基因組芯片(CGA)(CGA)是一種將可培養(yǎng)微生物的全基因組是一種將可培養(yǎng)微生物的全基因組DNA DNA 作為探針的技術(shù)作為探針的技術(shù), , 它的特異性高它的特異性高, ,可以鑒定到種甚至菌株水平可以鑒定到種甚至菌株水平; ; 敏感性強(qiáng)敏感性強(qiáng), , 只需只需0.2 ng0.2 ng的待分析的待分析基因組基因組DNA DNA 就可檢測。就可檢測。 CGA CGA 在微生物檢測、鑒定、量化、不同環(huán)境樣品的微生物菌群相關(guān)性或不同微在微生物檢測、鑒定、量化、不同環(huán)境樣品的微生物菌群相關(guān)性或不

12、同微生物基因組的相關(guān)性分析等方面將有著廣泛的前景。生物基因組的相關(guān)性分析等方面將有著廣泛的前景。宏基因組芯片宏基因組芯片(MGA)(MGA) 未培養(yǎng)微生物組成了地球上生物多樣性的主體未培養(yǎng)微生物組成了地球上生物多樣性的主體, ,據(jù)估計據(jù)估計, , 自然環(huán)境中超過自然環(huán)境中超過99%99%的的微生物不能用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行純培養(yǎng)微生物不能用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行純培養(yǎng), , 因此因此, , 人們開始通過免培養(yǎng)的技術(shù)即宏人們開始通過免培養(yǎng)的技術(shù)即宏基因組或直接從環(huán)境樣品中抽提克隆微生物的混合基因組或直接從環(huán)境樣品中抽提克隆微生物的混合DNA DNA 來研究環(huán)境樣品中微生來研究環(huán)境樣品中微生物基因組的功能和序列

13、分析。物基因組的功能和序列分析。 目前目前, , 利用該技術(shù)已進(jìn)行了酸礦外排液和利用該技術(shù)已進(jìn)行了酸礦外排液和Sargasso Sea Sargasso Sea 的微生物群落、活性的微生物群落、活性污泥和土壤細(xì)菌污泥和土壤細(xì)菌PHB PHB 代謝遺傳學(xué)等的研究。代謝遺傳學(xué)等的研究。 宏基因組芯片則是一種高通量文庫篩選技術(shù)宏基因組芯片則是一種高通量文庫篩選技術(shù), ,是一種將芯片技術(shù)和宏基因組是一種將芯片技術(shù)和宏基因組技術(shù)結(jié)合起來新技術(shù)技術(shù)結(jié)合起來新技術(shù), ,該技術(shù)無需分離培養(yǎng)菌株、無需了解菌群的基因序列。該技術(shù)無需分離培養(yǎng)菌株、無需了解菌群的基因序列。 它的探針來源于環(huán)境它的探針來源于環(huán)境DNA

14、 DNA 的宏基因組文庫的宏基因組文庫, ,可通過大腸桿菌作為宿主來構(gòu)建可通過大腸桿菌作為宿主來構(gòu)建, , 一般來說一般來說, MGA, MGA所包含的探針為所包含的探針為1 kb 1 kb 左右。左右。 該技術(shù)可以分析環(huán)境樣品微生物結(jié)構(gòu)和功能該技術(shù)可以分析環(huán)境樣品微生物結(jié)構(gòu)和功能; ;可以通過不同環(huán)境樣品宏基因組可以通過不同環(huán)境樣品宏基因組芯片的比較分析獲得某環(huán)境樣品菌群的代表芯片的比較分析獲得某環(huán)境樣品菌群的代表DNA DNA 探針。探針。 目前目前, MGA, MGA技術(shù)仍在發(fā)展初期技術(shù)仍在發(fā)展初期, , 但由于環(huán)境中存在大量的未知基因序列但由于環(huán)境中存在大量的未知基因序列, , 因因此

15、它在環(huán)境方面將具有巨大的應(yīng)用價值。此它在環(huán)境方面將具有巨大的應(yīng)用價值。展望展望新功能基因、新功能蛋白的挖掘。新功能基因、新功能蛋白的挖掘。環(huán)境樣品基因表達(dá)譜芯片的建立和環(huán)境樣品基因表達(dá)譜芯片的建立和差異表達(dá)基因的尋找。差異表達(dá)基因的尋找。環(huán)境新監(jiān)測技術(shù)的開發(fā)。環(huán)境新監(jiān)測技術(shù)的開發(fā)。氣候?qū)Νh(huán)境微生物群落的影響研究。氣候?qū)Νh(huán)境微生物群落的影響研究。環(huán)境樣品及其環(huán)境微生物群落研究環(huán)境樣品及其環(huán)境微生物群落研究環(huán)境樣品包括活性污泥、土壤、水、環(huán)境樣品包括活性污泥、土壤、水、煙、氣溶膠、淤泥、海洋沉積物等。煙、氣溶膠、淤泥、海洋沉積物等。而環(huán)境微生物群落研究包括環(huán)境樣而環(huán)境微生物群落研究包括環(huán)境樣品的微生物分布、種類、功能、動品的微生物分布、種類、功能、動力學(xué)變化及氣候、環(huán)境污染等環(huán)境力學(xué)變化及氣候、環(huán)境污染等環(huán)境因素改變對其微生物生態(tài)的影響等。因素改變對其微生物生態(tài)的影響等。環(huán)境樣品及其環(huán)境微生物群落研究環(huán)境樣品及其環(huán)境微生物群落研究環(huán)境樣品包括活性污泥、土壤、水、環(huán)境樣品包括活性污泥、土壤、水、煙、氣溶膠、淤泥、海洋沉積物等。煙、氣溶膠、淤泥、海洋沉積物等。而環(huán)境微生物群落研究包括環(huán)境樣而環(huán)境微生物群落研究包括環(huán)境樣品的微生物分布、種類、功能、動品的微生物分布、種類、功能、動力學(xué)變化及氣候、環(huán)境污染等環(huán)境力學(xué)變化及氣候、環(huán)境污染