試驗(yàn)十抗性菌株篩選

1、實(shí)驗(yàn)十用梯度平板法篩選大腸桿菌抗藥性突變株【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹浚毫私獠⑹煜た顾幮酝蛔冎甑暮Y選原理和方法【實(shí)驗(yàn)原理】：經(jīng)誘變處理后的微生物群體中，雖然突變的數(shù)目大大增加，但所占的比例仍 然是整個(gè)群體中的極少數(shù)。為了快速、準(zhǔn)確地得到所需的突變體，必須設(shè)計(jì)一個(gè)合理的篩選方法，以殺死大量的未發(fā)生突變的野生型，而保存極少數(shù)的突變型。梯度平板法是篩選抗藥性突變型的一種有效簡(jiǎn)便方法，其操作要點(diǎn)是：先參加不含藥物的培養(yǎng)基，立即吧培養(yǎng)皿斜放， 待培養(yǎng)基凝固后形成一個(gè)斜面， 再將培養(yǎng)皿平放，倒入含一 定濃度藥物的培養(yǎng)基， 這樣就形成一個(gè)藥物濃度梯度由濃到稀的梯度培養(yǎng)基，然后再將大量的菌液涂布于平板說(shuō)明上。經(jīng)培養(yǎng)后，在高濃

2、度藥物處出現(xiàn)的菌落就是抗藥性突變型菌株?！静牧虾推髅蟆浚?1)菌種：大腸埃希氏菌(2)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白月東瓊脂培養(yǎng)基，2X ( 2倍濃度)牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)液(分裝于小三角瓶中，每瓶裝20ml),生理鹽水。(3)器皿：培養(yǎng)皿，涂布棒，移液管，滴管，離心機(jī)【方法和步驟】：1制備菌液從已活化的斜面菌種上挑一環(huán)大腸埃希氏菌于裝有5ml牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)液的無(wú)菌離心管中(接2支離心管)，置37C條件下培養(yǎng)16h左右，離心(3500r/min , 10min),棄去上 清液后再生理鹽水洗滌2次，棄去上清液，重新懸浮于5ml的生理鹽水中。并且將2支離 心管的菌液一并倒入裝有玻璃珠的三角瓶中，充分振動(dòng)以分

3、散細(xì)胞，制成108/ml的菌液。然后吸3ml菌液于裝有磁力攪拌棒的培養(yǎng)皿中。2紫外線照射(1)預(yù)熱紫外燈：紫外燈功率為15W照射距離30CR!照射前先開(kāi)燈預(yù)熱30min。(2)照射：將培養(yǎng)皿放在磁力攪拌器上，先照射1min后再翻開(kāi)皿蓋并計(jì)時(shí)，當(dāng)照射達(dá)2Min后，立即蓋上皿蓋，關(guān)閉紫外燈。3增殖培養(yǎng)(在暗室紅燈下操作)照射完畢，用無(wú)菌滴管將全部菌液吸到含有3ml 2 X牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)液的小三角瓶中，混勻后用黑紙包裹嚴(yán)密，置37C培養(yǎng)過(guò)夜。4制備梯度培養(yǎng)皿取10ml牛肉膏蛋白月東瓊脂培養(yǎng)基于直徑9cm的培養(yǎng)皿中，立即將培養(yǎng)皿斜放，使高處的培養(yǎng)基正好位于皿邊與皿底的交接處。待凝固后，將培養(yǎng)皿平放

4、，在參加含有鏈霉素(100g/ml )的牛肉膏蛋白腺瓊脂培養(yǎng)基10ml。待凝固后，便得到鏈霉素從到0逐漸遞減的濃度梯度培養(yǎng)皿。然后在皿底做一個(gè)“ f 符號(hào)標(biāo)記。5涂布菌液將增殖后的菌液進(jìn)行離心(3500r/min , 10min),棄去上清液，再參加少量生理鹽水(約0.2ml),制成濃的菌液后將全部菌液涂布于梯度培養(yǎng)皿上，并將它倒置于37 C恒溫箱中培養(yǎng)24h,然后將出現(xiàn)于高藥物濃度區(qū)內(nèi)的單菌落分別接種到斜面上，經(jīng)培養(yǎng)后再做抗藥性測(cè) 定。6抗藥性測(cè)定(1)制備含藥平板：取鏈霉素溶液(750 g/ml) 0.2、0.4、0.6、0.8ml ,分別加到無(wú)菌培 養(yǎng)皿中，再參加融化并冷卻到50C左右的

5、牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基15ml,立即混勻，平置凝固 后即成一個(gè)對(duì)照平板(不含藥物)。(2)抗藥性的測(cè)定：將上述每個(gè)皿底的外面用記號(hào)筆畫(huà)成8等分，并注明18號(hào)，然后將假設(shè)干抗藥菌株逐個(gè)劃在上述4種濃度的藥物平板上和對(duì)照平板上。每一皿必須留一格接種出發(fā)菌株。然后將所有的培養(yǎng)皿倒置于37C恒溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天觀察各菌株的生長(zhǎng)情況，并記錄結(jié)果?！窘Y(jié)果記錄】將各菌株抗藥性測(cè)定結(jié)果記錄于下表中。國(guó)株勺含藥平板/ (g.ml )對(duì)照平板不含藥物10203040012345678出發(fā)菌株注：以+表示生長(zhǎng)，-表示不生長(zhǎng)。結(jié)果：你選到抗藥菌株 株，最高抗藥性達(dá)itg/ml?！究记绊氈浚?制備含藥平板時(shí)，務(wù)必使藥物與培養(yǎng)基充分混勻。2嚴(yán)格無(wú)菌操作，勿將含藥平板上的雜菌誤認(rèn)為是抗藥性大腸埃希氏菌。 【思考題