第八章蛋白質(zhì)工程

1、第八章第八章 蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 袁婺洲袁婺洲本章目錄本章目錄l蛋白質(zhì)工程的理論基礎(chǔ)蛋白質(zhì)工程的理論基礎(chǔ)l蛋白質(zhì)工程的理論基礎(chǔ)蛋白質(zhì)工程的理論基礎(chǔ)l蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定與結(jié)構(gòu)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定與結(jié)構(gòu)預(yù)測l蛋白質(zhì)工程的關(guān)鍵技術(shù)蛋白質(zhì)工程的關(guān)鍵技術(shù)l定點突變定點突變l定向進(jìn)化定向進(jìn)化l其他技術(shù)其他技術(shù)l蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用及實例蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用及實例l定點突變與蛋白質(zhì)藥物工程：胰島素定點突變與蛋白質(zhì)藥物工程：胰島素l定點突變、定向進(jìn)化與工業(yè)用酶：枯草桿菌蛋白酶等定點突變、定向進(jìn)化與工業(yè)用酶：枯草桿菌蛋白酶等l結(jié)構(gòu)域的拼接與金屬硫蛋白工程結(jié)構(gòu)域的拼接與金屬硫

2、蛋白工程l抗體工程抗體工程 第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)工程的理論基礎(chǔ)蛋白質(zhì)工程的理論基礎(chǔ)l蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程的概念l蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)l蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測一一 蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程的概念l基于對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識，進(jìn)行分子設(shè)計，通過基于對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識，進(jìn)行分子設(shè)計，通過基因工程途徑定向地改造蛋白質(zhì)或創(chuàng)造合乎人類需要的基因工程途徑定向地改造蛋白質(zhì)或創(chuàng)造合乎人類需要的新的突變蛋白質(zhì)的理論或?qū)嵺`活動。新的突變蛋白質(zhì)的理論或?qū)嵺`活動。 （1 1）確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的）確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系；關(guān)系；（2 2）通過定點

3、突變、定向進(jìn)化等技術(shù)，合成具有特定氨）通過定點突變、定向進(jìn)化等技術(shù)，合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。 二二 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)l一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)：多肽鏈的氨基酸殘基的排列順序：多肽鏈的氨基酸殘基的排列順序 l二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助于氫鍵或離子鍵沿一維方向排列成具：多肽鏈借助于氫鍵或離子鍵沿一維方向排列成具有周期性結(jié)構(gòu)的圖象。有周期性結(jié)構(gòu)的圖象。 l三級結(jié)構(gòu)：三級結(jié)構(gòu)：指整個蛋白質(zhì)多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，側(cè)鏈指整個蛋白質(zhì)多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，側(cè)鏈基團(tuán)通過次級鍵或疏水鍵的相互作用進(jìn)一步盤曲折疊，形成基團(tuán)通過次級鍵或疏水鍵的相互作用進(jìn)一步盤曲折

4、疊，形成具有一定規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)具有一定規(guī)則的空間結(jié)構(gòu) 。l四級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)：由兩條以上的多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，多肽鏈之間：由兩條以上的多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，多肽鏈之間沒有共價鍵連接而是借疏水作用等次級鍵締合在一起形成的沒有共價鍵連接而是借疏水作用等次級鍵締合在一起形成的高級空間結(jié)構(gòu)高級空間結(jié)構(gòu) 。氨基酸的聚合形成肽鏈氨基酸的聚合形成肽鏈肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元: : 二硫鍵的折疊二硫鍵的折疊肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元 : :氫鍵的折疊氫鍵的折疊肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元 : :離子鍵的折疊離子鍵的折疊肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元l每四個氨基酸每四個氨基酸殘基

5、間的殘基間的l氫鍵構(gòu)成多肽氫鍵構(gòu)成多肽鏈鏈 a a 螺旋螺旋肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元l由不同多肽鏈由不同多肽鏈上氨基酸殘基上氨基酸殘基間的氫鍵構(gòu)成間的氫鍵構(gòu)成多肽鏈多肽鏈 b b 折疊折疊肽鏈的完整空間構(gòu)象肽鏈的完整空間構(gòu)象蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系l蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，而空間結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，而空間結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的功能。蛋白質(zhì)的功能。l結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域：蛋白質(zhì)多肽鏈上一段在三維結(jié)構(gòu)上可以明顯區(qū)蛋白質(zhì)多肽鏈上一段在三維結(jié)構(gòu)上可以明顯區(qū)分和相對獨立并具有一定生物學(xué)功能的基本單位。分和相對獨立并具有一定生物學(xué)功能的基本單位。 l模體

6、（基序）：模體（基序）：組成結(jié)構(gòu)域的基本二級結(jié)構(gòu)單位組成結(jié)構(gòu)域的基本二級結(jié)構(gòu)單位 蛋白質(zhì)的加工修飾蛋白質(zhì)的加工修飾 : :磷酸化修飾磷酸化修飾蛋白質(zhì)的加工修飾蛋白質(zhì)的加工修飾: :羧基化修飾羧基化修飾幾種參與凝血的蛋幾種參與凝血的蛋白因子（如白因子（如 VIII VIII 和和IVIV因子）需要在因子）需要在其其谷酰胺側(cè)鏈上的谷酰胺側(cè)鏈上的g-g-羧基化修飾羧基化修飾后，后，才能擁有蛋白酶的才能擁有蛋白酶的活性，這一修飾過活性，這一修飾過程依賴與程依賴與維生素維生素K K 的存在的存在。蛋白質(zhì)的加工修飾蛋白質(zhì)的加工修飾: :甲基化修飾甲基化修飾肌肉中的一些蛋白質(zhì)以及細(xì)肌肉中的一些蛋白質(zhì)以及細(xì)胞

7、色素胞色素C C中的中的LysLys會受到單甲會受到單甲基和二甲基化修飾；鈣調(diào)蛋基和二甲基化修飾；鈣調(diào)蛋白會受到三甲基化修飾；所白會受到三甲基化修飾；所有有C C末端以末端以GluGlu結(jié)尾的蛋白質(zhì)，結(jié)尾的蛋白質(zhì)，其其GluGlu會會受到甲基化修飾。受到甲基化修飾。蛋白質(zhì)的加工修飾蛋白質(zhì)的加工修飾:N-糖基化糖基化O-糖基化糖基化糖基化修飾糖基化修飾蛋白質(zhì)的加工修飾蛋白質(zhì)的加工修飾: :其它類型的修飾其它類型的修飾三三 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測l一級結(jié)構(gòu)：測序儀與數(shù)據(jù)庫一級結(jié)構(gòu)：測序儀與數(shù)據(jù)庫l高級結(jié)構(gòu)預(yù)測：高級結(jié)構(gòu)預(yù)測： X X射線晶體衍射法射線晶體衍射法 核磁共振法（核磁共振法（N

8、MRNMR）蛋白質(zhì)一級序列數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)一級序列數(shù)據(jù)庫lPIR PIR ：由國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會（由國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會（NBRFNBRF）建立）建立lMIPSMIPS：MartinsriedMartinsried的蛋白質(zhì)序列研究所收集和處理的的蛋白質(zhì)序列研究所收集和處理的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)lSWISS-PROTSWISS-PROT：蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，由蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，由GenevaGeneva大學(xué)和大學(xué)和EMBLEMBL共同合作開發(fā)共同合作開發(fā) lTrEMBLTrEMBL：翻譯的翻譯的EMBL EMBL lNRL-3DNRL-3D：除序列信息外，也包括對二級結(jié)構(gòu)，活性位點，除序

9、列信息外，也包括對二級結(jié)構(gòu)，活性位點，結(jié)合位點和修飾位點等信息。結(jié)合位點和修飾位點等信息。 第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)工程關(guān)鍵技術(shù)蛋白質(zhì)工程關(guān)鍵技術(shù)l定點突變定點突變 l定向進(jìn)化定向進(jìn)化l其他技術(shù)其他技術(shù)一一 定點突變定點突變l寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變 lPCRPCR介導(dǎo)的定點突變介導(dǎo)的定點突變 l盒式突變盒式突變遺傳信息傳遞的中心法則DNA（基因）DNA（基因）mRNA蛋白質(zhì)生物代謝物質(zhì)復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯代謝基因組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)蛋白組學(xué)代謝組學(xué)逆轉(zhuǎn)錄中心法則中心法則1. 1. 寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變l用含有用含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物突變堿基的

10、寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下，在聚合酶的作用下啟動啟動DNADNA分子進(jìn)行復(fù)制的過程分子進(jìn)行復(fù)制的過程 l寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變的寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變的KunkelKunkel改進(jìn)改進(jìn) ： 載體：載體：RFRFM13DNAM13DNA載體載體 菌株：菌株：dUTPdUTP酶和酶和N N尿嘧啶脫核苷酶雙缺陷的菌株。尿嘧啶脫核苷酶雙缺陷的菌株。 原理：原理：dUTPdUTP酶缺陷導(dǎo)致胞內(nèi)酶缺陷導(dǎo)致胞內(nèi)dUTPdUTP上升，部分取代上升，部分取代dTTPdTTP進(jìn)入進(jìn)入新生新生DNADNA鏈中，使得鏈中，使得M13M13單鏈單鏈DNADNA大約大約1 1的的T T被被U U取代。另

11、一鏈取代。另一鏈合成后，將雙鏈合成后，將雙鏈DNADNA導(dǎo)入正常大腸桿菌，導(dǎo)入正常大腸桿菌，N N尿嘧啶糖基化酶尿嘧啶糖基化酶除去除去DNADNA鏈上的尿嘧啶堿基，原鏈上的尿嘧啶堿基，原M13M13模板鏈被降解，突變鏈因模板鏈被降解，突變鏈因不含不含U U被保留下來。被保留下來。 2. PCRPCR介導(dǎo)的定點突變介導(dǎo)的定點突變 3. 3. 盒式突變盒式突變l利用一段利用一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列。突變的寡核苷酸鏈成對取代野生型基因中的相應(yīng)序列。突變的寡核苷酸鏈成對存在，不會出現(xiàn)異源雙鏈的情況。全部轉(zhuǎn)化質(zhì)粒都是突存

12、在，不會出現(xiàn)異源雙鏈的情況。全部轉(zhuǎn)化質(zhì)粒都是突變體。變體。二、二、 定向進(jìn)化定向進(jìn)化l先隨機(jī)突變，再定向選擇。先隨機(jī)突變，再定向選擇。如在待進(jìn)化酶基因的如在待進(jìn)化酶基因的PCRPCR擴(kuò)擴(kuò)增反應(yīng)中，利用增反應(yīng)中，利用TaqTaq酶不具有酶不具有3 35 5端糾錯的功能，配合端糾錯的功能，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因引入突變，構(gòu)建突適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因引入突變，構(gòu)建突變序列庫，再憑借定向的選擇方法，定向選出所需性質(zhì)變序列庫，再憑借定向的選擇方法，定向選出所需性質(zhì)的突變酶。的突變酶。1. 1. 易錯易錯PCRPCRl在在PCRPCR反應(yīng)中，降低反應(yīng)中，降低一種一種dNTPdNTP

13、的含量的含量，使，使PCRPCR容易出錯，容易出錯，達(dá)到隨機(jī)突變的目的。達(dá)到隨機(jī)突變的目的。 2. DNA2. DNA改組改組l用用DNAaseIDNAaseI 先將一個先將一個DNADNA片段消化成許多小片段，然后片段消化成許多小片段，然后不加引物進(jìn)行不加引物進(jìn)行PCRPCR，使得消化后，使得消化后DNADNA小段之間重新按多種小段之間重新按多種組合方式連接重組，然后利用原來整片段組合方式連接重組，然后利用原來整片段DNADNA兩端的引兩端的引物進(jìn)行物進(jìn)行加引物的加引物的PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增，以便得到一系列改組后的突，以便得到一系列改組后的突變變DNADNA序列。序列。3. 3. 體外隨機(jī)引

14、發(fā)重組體外隨機(jī)引發(fā)重組l以以單鏈單鏈DNADNA為模板為模板，隨機(jī)引物擴(kuò)增，隨機(jī)引物擴(kuò)增，將產(chǎn)生大量與模板將產(chǎn)生大量與模板不同位點互補(bǔ)的短的不同位點互補(bǔ)的短的DNADNA片段，由于堿基的錯配和錯誤片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些短引發(fā)，這些短DNADNA片段中會存在一些點突變。片段中會存在一些點突變。 第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實例蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實例l胰島素胰島素l枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶 l金屬硫蛋白金屬硫蛋白 l抗體抗體1. 1. 胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成SSSSCNSSB肽（肽（30）C肽（肽（31）A肽（肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高爾基

15、體內(nèi)的特異性肽酶高爾基體內(nèi)的特異性肽酶NlCB肽肽C肽肽A肽肽信號肽酶信號肽酶信號肽信號肽胰島素的改建工程胰島素的改建工程l速效胰島素：速效胰島素：Ser B9 Asp/ Ser B9 Asp/ ThrThr B27 B27 GluGlu，有利于降低，有利于降低胰島素的締合作用，進(jìn)入血液的吸收率比天然胰島素提胰島素的締合作用，進(jìn)入血液的吸收率比天然胰島素提高了高了3 3倍。倍。l長效胰島素：長效胰島素：AsnAsn A21 A21 GlyGly/ / ThrThr B27 B27 ArgArg/ / ThrThr B30 B30 ThrThr酰胺，半衰期最長，達(dá)到酰胺，半衰期最長，達(dá)到35.535.5小時。小時。l高效胰島素高效胰島素：His B10 Asp, His B10 Asp, 活力是天然胰島素的活力是天然胰島素的11.711.7倍。倍。 抗體抗體l抗體是一類免疫球蛋白抗體是一類免疫球蛋白IgG基本結(jié)構(gòu)重鏈重鏈（heavy chainheavy chain，H H）輕鏈輕鏈（light chainlight chain，L L） 可變區(qū)（可變區(qū)（variable region, Vvariable region, V區(qū)）區(qū)）恒定區(qū)恒定區(qū)（co