特殊毒性試驗(yàn)

1、特殊毒性試驗(yàn)特殊毒性試驗(yàn)致癌作用及其試驗(yàn)方法致癌作用及其試驗(yàn)方法l致癌作用的基本概念l化學(xué)致癌物的分類(lèi)基本概念基本概念l癌癌是上皮織織發(fā)生的惡性腫瘤，但在致癌作用概念中的“癌”既包括惡性腫瘤，也包括良性腫瘤。l致癌物致癌物是指具有誘發(fā)腫瘤形成能力的物質(zhì)，致癌物誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生和形成的過(guò)程稱為致癌作用化學(xué)致癌物的分類(lèi)化學(xué)致癌物的分類(lèi)l遺傳毒性致癌物l非遺傳毒性致癌物l暫未確定遺傳毒性的致癌物遺傳毒性致癌物遺傳毒性致癌物l 遺傳毒性致癌物遺傳毒性致癌物 能與DNA發(fā)生共價(jià)健結(jié)合，造成對(duì)DNA損傷的致癌物l直接致癌物：能直接與親核分于(包括DNA)共價(jià)鍵結(jié)合形成加臺(tái)物，這類(lèi)物質(zhì)絕大多數(shù)是合成的有機(jī)物，如

2、烯比環(huán)氧物、亞胺類(lèi)、芥子氣、活性鹵代烴類(lèi)等；l前致癌物：需要代謝活化后才能與洲A反應(yīng)造成DN八損傷致癌，如苯并芘(3)、鄰苯甲胺l無(wú)機(jī)致癌物：有些能損傷DNA或是通過(guò)改變DNA聚合酶的保真性而致癌，如鎳、鈦等非遺傳毒性致癌物非遺傳毒性致癌物 不與DNA發(fā)生反應(yīng)的致癌物l促癌劑：?jiǎn)为?dú)不致癌，必須與致病物同時(shí)接觸機(jī)體才呈現(xiàn)作用l激素l免疫抑制劑免疫抑制劑l過(guò)氧化物酶體增生劑過(guò)氧化物酶體增生劑暫未確定遺傳毒性的致癌物暫未確定遺傳毒性的致癌物l這類(lèi)致癌物未能證明損傷未能證明損傷DNA，其致癌方式尚未完全闡明l四氯化碳、氯仿、高氯烷烴化學(xué)致癌機(jī)制化學(xué)致癌機(jī)制l體細(xì)胞突變學(xué)說(shuō)體細(xì)胞突變學(xué)說(shuō)： 正常體細(xì)胞的

3、基因在致癌物的作用下發(fā)生突變，進(jìn)一步增殖形成腫瘤l親電共價(jià)結(jié)合學(xué)說(shuō)親電共價(jià)結(jié)合學(xué)說(shuō)：某些致癌物必須經(jīng)過(guò)代謝活化而成為活性代謝產(chǎn)物(終致癌物），終致癌物合有親電子中心，可與細(xì)胞大分子的親核中心共價(jià)結(jié)合致癌l癌基因?qū)W說(shuō)癌基因?qū)W說(shuō)： 發(fā)現(xiàn)病毒致癌是由于攜帶了能致癌的遺傳信息，即癌基因。病毒癌基因直接或經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄后，整合于宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，從而發(fā)揮其致癌作用l化學(xué)致癌的階段學(xué)說(shuō)：化學(xué)致癌過(guò)程引起腫瘤可分為三個(gè)階段分為三個(gè)階段致癌試驗(yàn)方法致癌試驗(yàn)方法l致癌試驗(yàn)的目的是對(duì)某種化學(xué)物是否具有致癌的危險(xiǎn)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，它包括短期致癌試驗(yàn)短期致癌試驗(yàn)和長(zhǎng)長(zhǎng)期致癌試驗(yàn)期致癌試驗(yàn)。 短期致癌試驗(yàn)短期致癌試驗(yàn)l惡性轉(zhuǎn)化試

4、驗(yàn)l哺乳動(dòng)物短期致癌試驗(yàn)惡性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)惡性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)l是指利用培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞接觸受試物后，觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的試驗(yàn)。觀察其細(xì)胞形細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)力、生化特性等變化、以及移植態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)力、生化特性等變化、以及移植于動(dòng)物體內(nèi)能形成腫瘤于動(dòng)物體內(nèi)能形成腫瘤的能力。l惡性轉(zhuǎn)比的細(xì)胞偏大且大小不等細(xì)胞偏大且大小不等，核大而 畸形，核膜粗厚，染色質(zhì)深染且粗糙，核質(zhì)比例倒置，核仁增生肥大。核仁和腦質(zhì)均由于RNA增多而偏酸性，故呈嗜堿性染色而偏增多而偏酸性，故呈嗜堿性染色而偏藍(lán)，核分裂多見(jiàn)哺乳動(dòng)物短期致癌試驗(yàn)哺乳動(dòng)物短期致癌試驗(yàn)l又稱有限動(dòng)物試驗(yàn)有限動(dòng)物試驗(yàn)，是指在有限的40周內(nèi)，觀察某個(gè)靶器官或組織l

5、小鼠肺腫瘤誘發(fā)試驗(yàn)l大鼠肝轉(zhuǎn)變?cè)钫T發(fā)試驗(yàn)l小鼠皮膚腫瘤誘發(fā)試驗(yàn)小鼠肺腫瘤誘發(fā)試驗(yàn)小鼠肺腫瘤誘發(fā)試驗(yàn)l多采用對(duì)肺腫瘤敏感的品系小鼠，于一次或多次給予受試物后或根據(jù)需要再多次給予促癌劑(常用丁基羥甲苯)，可在16-30周左右結(jié)束試驗(yàn)。若受試物具有誘發(fā)腫瘤作用，無(wú)論是大體解剖或者鏡下都可見(jiàn)受試物誘發(fā)的腫瘤或癌。大鼠肝轉(zhuǎn)變?cè)钫T發(fā)試驗(yàn)大鼠肝轉(zhuǎn)變?cè)钫T發(fā)試驗(yàn)l肝癌發(fā)生過(guò)程有明顯的階段性特點(diǎn)，且可則肝細(xì)胞病灶(肝轉(zhuǎn)變?cè)?和瘤性結(jié)節(jié)。由于最早出現(xiàn)的肝轉(zhuǎn)變?cè)羁尚〉綆讉€(gè)細(xì)胞組成，因此常規(guī) 切片病檢技術(shù)易漏檢。采用酶組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，可早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)變?cè)詈土鲂越Y(jié)節(jié)中許多酶學(xué)改變，表明這些病變是肝癌細(xì)胞。哺乳

6、動(dòng)物長(zhǎng)期致癌試驗(yàn)哺乳動(dòng)物長(zhǎng)期致癌試驗(yàn)l物種選擇l劑量與分組l染毒途徑l試驗(yàn)期限與染毒時(shí)間l結(jié)果觀察物種選擇物種選擇l在致癌試驗(yàn)中選擇動(dòng)物最重要的依據(jù)是誘發(fā)腫瘤的易感性，必須考慮物種、品系、年齡、性別和受試物特定的靶器官l大鼠對(duì)誘發(fā)肝癌敏感，金黃地鼠對(duì)誘發(fā)膀胱癌敏感l(wèi)一般多用嚙齒動(dòng)物，因其敏感性高，壽命相對(duì)較短，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡多用幼年動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡多用幼年動(dòng)物，雌雄各半劑量與分組劑量與分組l一般設(shè)23個(gè)劑量組。原則上要盡可能采用較高劑量，以便縮短出現(xiàn)腫瘤的潛伏期，排除易感動(dòng)物的個(gè)體差異，在較短時(shí)間內(nèi)得出陽(yáng)性結(jié)果。但劑量也不能過(guò)高。？但劑量也不能過(guò)高。？l高劑量組可采用動(dòng)物的最大耐受量(MTD

7、)，較低劑量組為前一級(jí)高劑量組的14-13，最低劑量組相當(dāng)于人類(lèi)實(shí)際接觸的劑量。同時(shí)應(yīng)同時(shí)應(yīng)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組l每組動(dòng)物數(shù)雌雄至少各25-50只，在出現(xiàn)第一個(gè)腫瘤時(shí)每組動(dòng)物數(shù)不應(yīng)少于25只染毒途徑染毒途徑l 在選樣染毒途徑時(shí)應(yīng)考慮試驗(yàn)?zāi)康?、受試物的性質(zhì)及用途以及人類(lèi)實(shí)際接觸情況等試驗(yàn)期限與染毒時(shí)間試驗(yàn)期限與染毒時(shí)間 l試驗(yàn)期限：要求長(zhǎng)期或終生、一股情況下小鼠最少1.5年大鼠2年；可能時(shí)分別延長(zhǎng)至2年至2.5年。染毒時(shí)間可從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斷奶實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斷奶時(shí)時(shí)開(kāi)始，不遲于出生后7-9周。結(jié)果的觀察、分析評(píng)定結(jié)果的觀察、分析評(píng)定l試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)每天密切觀察動(dòng)物1-2次，除一般綜

8、合性指標(biāo)外，主要觀察腫瘤出現(xiàn)時(shí)間、發(fā)生部位、數(shù)目、性質(zhì)和大小。瀕死或死亡動(dòng)物 和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)即刻處死的動(dòng)物，都應(yīng)進(jìn)行病理檢查觀察指標(biāo)觀察指標(biāo)l潛伏期：是指從動(dòng)物接觸受試物開(kāi)始，到出現(xiàn)第一個(gè)腫瘤的天數(shù)l腫瘤發(fā)生率：是指試驗(yàn)終了時(shí)患瘤動(dòng)物總數(shù)在有效動(dòng)物總數(shù)有效動(dòng)物總數(shù)中所占的百分率l多發(fā)性：是指一個(gè)動(dòng)物或一個(gè)器官出現(xiàn)多個(gè)腫瘤，腫瘤的多發(fā)性是化學(xué)致癌的特征致癌物評(píng)價(jià)程序致癌物評(píng)價(jià)程序l化學(xué)物的結(jié)構(gòu)分析l短期致突變?cè)囼?yàn)l短期動(dòng)物致癌試驗(yàn)l長(zhǎng)期動(dòng)物致癌試驗(yàn)l腫瘤流行病學(xué)研究致畸作用及試驗(yàn)方法致畸作用及試驗(yàn)方法l 胚胎在發(fā)育過(guò)程中，由予各種原因造成器官形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常，稱為畸形具有畸形的胚胎或胎仔，稱為畸胎。

9、凡能引起胚胎發(fā)生畸形的化學(xué)物稱為致畸物或致畸原。化學(xué)物通過(guò)母體作用于胚胎而引起胎兒畸形的現(xiàn)象稱為致畸作用。廣義的致畸作用還包括引起胚胎發(fā)育遲緩、功還包括引起胚胎發(fā)育遲緩、功能不全和胚胎死亡能不全和胚胎死亡。致畸物致畸物l化學(xué)致畸物：烷化劑、反應(yīng)停烷化劑、反應(yīng)停、激素、孕激素、抗代謝物、甲級(jí)汞等影響致畸作用的因素影響致畸作用的因素l化學(xué)物的理化性質(zhì)l作用時(shí)機(jī)l劑量l遺傳因素l其他因素致畸作用機(jī)制致畸作用機(jī)制l突變引起胚胎發(fā)育異常 化學(xué)物作用于生殖細(xì)胞，引起遺傳基因突變所產(chǎn)生的子代畸形具有遺傳性，作用于胚胎體細(xì)胞引起的畸形是非遺傳性的l胚胎細(xì)胞代謝障礙 胚胎排除化學(xué)物的速度比母體慢，又因胎兒缺乏肝

10、微粒體酶，這致使某些致畸物在胚胎或胎兒期體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程與成人不同，以至于在胚胎內(nèi)蓄積、造成胚胎中間代謝障礙和能量供應(yīng)不足影響DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂及組織分化過(guò)程而導(dǎo)致畸形l細(xì)胞毒性作用 化學(xué)致畸物進(jìn)入胚胎后，表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用，引起細(xì)胞死亡或細(xì)胞增殖抑制，導(dǎo)致這些組織器官畸形l胚胎組織發(fā)育過(guò)程的不協(xié)調(diào) 胚胎正常結(jié)構(gòu)的形成、依賴于多種細(xì)胞和組織在增殖、分化和生長(zhǎng)上的高度協(xié)調(diào)。某些化學(xué)物對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程中的某些細(xì)胞或組織增殖分化過(guò)程的干擾，可造成各種細(xì)胞和組織之間在時(shí)間和空間關(guān)系上的紊亂，導(dǎo)致特定的組織、器官、系統(tǒng)的發(fā)育異常。致畸試驗(yàn)方法致畸試驗(yàn)方法l物種選擇l劑量與分組l動(dòng)物交配處理l致畸效應(yīng)檢

11、查物種選擇物種選擇l 致畸試驗(yàn)中動(dòng)物的選擇除參照一般毒性試驗(yàn)的原則外，還應(yīng)選擇孕期較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)孕期較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多、胎盤(pán)結(jié)構(gòu)和代謝途徑與人類(lèi)接近較多、胎盤(pán)結(jié)構(gòu)和代謝途徑與人類(lèi)接近的動(dòng)物，其自然畸形發(fā)生率要低。一般首選大鼠其次是小鼠或家免。劑量的設(shè)置劑量的設(shè)置l 受試動(dòng)物分為2-3個(gè)劑量組，另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。先求出成年雌鼠的LD50，以15-13LD50為高劑量組，l100-130 LD50為低劑量組，若實(shí)際接觸量作為低別量組；并以其10倍左右為高劑量組組動(dòng)物的交配處理動(dòng)物的交配處理l將性成熟的動(dòng)物按雌雄1：1或2：1比例同籠交 配，并準(zhǔn)確查知其受精日期。為此，每日清晨進(jìn)行雌性動(dòng)物雌性動(dòng)物陰栓脫落陰栓脫落，以確認(rèn)雌件動(dòng)物是否受精 陰栓是排鼠精囊與凝固腺分泌液在雌鼠陰道凝結(jié)而成的白色塊狀物，形似米粒，交配后能在雌鼠陰道外部出現(xiàn)。大鼠的陰拴極易脫落，次日可在籠下的載盤(pán)中發(fā)現(xiàn)。小鼠的陰拴不易脫落，在陰道內(nèi)才能查到。