實(shí)驗(yàn)一食品中大腸菌群的測(cè)定

1、大腸菌群的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模海?1）了解大腸菌群在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中的意義（ 2）學(xué)習(xí)并掌握大腸菌群的檢驗(yàn)原理和方法，以判別食品的衛(wèi)生質(zhì)量二、實(shí)驗(yàn)原理：大腸菌群系指一群能在 37經(jīng)24h 能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。 該菌主要來(lái)源于人畜糞便， 故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量， 具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。 它反映了食品是否被糞便污 染，同時(shí)間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。食品中大腸菌群數(shù)系以每100g （或ml）檢樣內(nèi)大腸菌群最近似數(shù)（the m ost probablenumber-簡(jiǎn)稱 MPN 表示。最近似數(shù)（most probable num

2、ber-簡(jiǎn)稱MPN法是一種將樣品“多次（管）稀釋至無(wú)菌”的計(jì)數(shù)方法。將 3個(gè) 稀釋梯度的檢樣稀釋液接種于 9 支或 15 支試管培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度接種 3 支 或5支。經(jīng)培養(yǎng)后，根據(jù)結(jié)果查閱MPN僉索表，就可得到原樣品中微生物的估計(jì) 數(shù)量。MPN«定方法尤其適用于帶菌量極少、其他方法不能檢測(cè)的食品。如水、 乳制品及其他食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。三、材料1、樣品乳、肉、禽蛋制品、飲料、糕點(diǎn)、發(fā)酵調(diào)味品或其他食品。2、菌種大腸埃希氏菌（ Escherichia coli ）產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacteria aerogenes）3、培養(yǎng)基及試劑單料乳糖膽鹽發(fā)酵管、雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管、

3、乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB） 、革蘭氏染色液、蛋白陳水、靛基質(zhì)試劑、麥康凱（MA）4、其它設(shè)備和材料溫箱（36 ± 1） C、水浴鍋（44 ±C、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計(jì)、平皿、試管、發(fā)酵管、吸管、載玻片、接種針。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）檢驗(yàn)程序大腸菌群檢驗(yàn)程序見圖（二）操作步驟1 .采樣及稀釋（具體材料）以無(wú)菌操作鮮橙多飲料（具體根據(jù)實(shí)驗(yàn)室提供的確定）25g（或25mL）放于含有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi) （瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠 ）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng) 充分振搖或研磨做成 1: 10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無(wú)菌均質(zhì)器，以8000r/

4、mjn 10000r/min的速度處理1min,做成1: 10的稀釋液。用1mL滅菌吸管吸取1： 10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖?！勻，做成 1: 100的稀釋液，換用1支lmL滅菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋液。根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗(yàn)樣品污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。2 .乳糖初發(fā)酵試驗(yàn)即通常所說(shuō)的假定試驗(yàn)。其目的在于檢查樣品中有無(wú)發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體的細(xì)菌。將待校樣品接種子乳糖服鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管1mL及1mL以下者，用單料乳糖發(fā)酵管。每一個(gè)稀釋度接種3管，置（36

5、± 1）C培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)（24 ± 2）h,的所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣， 則可報(bào)告為大腸菌群陰性， 如有產(chǎn)生者， 則按下列程序進(jìn)行。如有產(chǎn)生者，則按下列程序進(jìn)行。3 .分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂板，置（36 ± 1） C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18h24h,:然后取出，觀察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色鏡檢和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。4 .乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)即通常所說(shuō)的證實(shí)試驗(yàn)，其目的在于證明從乳糖初酪管試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)的試管內(nèi)分離到的革蘭氏陰性無(wú)芽抱桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體。在上述的選擇性培養(yǎng)基上，挑取可疑大腸菌群1 2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置（36 士 l） C

6、的溫箱內(nèi)培養(yǎng)（24 ± 2）h ,觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣.革蘭氏染色為陰性反應(yīng)的無(wú)芽胞桿菌，即報(bào)告為大腸桿菌陽(yáng)性；凡糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣或革蘭氏染色為陽(yáng)性，則報(bào)告為大腸桿菌為陰性。5 .報(bào)告根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN僉索表（見表54）,報(bào)告每100mL（8）食品中大腸菌群的最可能數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果表接種量管號(hào)發(fā)酵反應(yīng)結(jié)果有無(wú)典型菌落革蘭氏染色結(jié)果復(fù)發(fā)酵反應(yīng)結(jié)果最后結(jié)論+或-123123123注：填寫初發(fā)酵與復(fù)發(fā)酵結(jié)果應(yīng)以下列符號(hào)表示?！?"表示不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基為紫色；“ +”表示只產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基變黃色；“”表示產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，培養(yǎng)基變黃，并有氣泡。結(jié)果報(bào)告根

7、據(jù)證實(shí)大腸菌群的陽(yáng)性管數(shù)，查MPN索表（見附錄）報(bào)告每100ml（克）大 腸菌群的最可能數(shù).6 .附件1g檢樣中最近似值（MPN）表 使用三管法，接種量分別為，和。大腸菌群MPN僉索表陽(yáng)性管數(shù)MPN95碗信限1ml (g) x 3(g) X3(g) X 3100 ml (g)下限上限0003000130v 590002600039001030v 5130011600129001312002060021900221200231600309003113003216003319010040V 520010170102101021101031501107010230111110303601121501

8、131901201103036012115012220012324013016013120013224013329020090103602011403037020220020326021015030440211200708902122702133402202104047022128010015002223502234202302902313602324402335303002304012003013907013003026401503800303950310430702100311750140230031212003003800313160032093015038003211500300440032221003504700323290033024003601300033146007102400033211000150048000333蘭 24000注：本表采用3個(gè)稀釋度0.1g(mL)、(mL)和0.001g(mL),每個(gè)稀釋度接種 3管。表內(nèi)所列檢樣量如改用1g(mL)、(mL)和0.01g(mL)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍:如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增 加