代謝控制和育種

1、第四節(jié) 代謝調(diào)節(jié)控制育種7 工業(yè)微生物代謝控制育種第四節(jié) 代謝調(diào)節(jié)控制育種 代謝調(diào)節(jié)控制育種通過(guò)特定突變型的選育，達(dá)到改變代謝通路、降低支代謝調(diào)節(jié)控制育種通過(guò)特定突變型的選育，達(dá)到改變代謝通路、降低支路代謝終產(chǎn)物的產(chǎn)生或切斷支路代謝途徑及提高細(xì)胞膜的透性，使代謝流路代謝終產(chǎn)物的產(chǎn)生或切斷支路代謝途徑及提高細(xì)胞膜的透性，使代謝流向目的產(chǎn)物積累方向進(jìn)行。向目的產(chǎn)物積累方向進(jìn)行。抗反饋調(diào)節(jié)突抗反饋調(diào)節(jié)突變株選育變株選育l1. 1. 概念：概念：指操縱基因或調(diào)節(jié)基因突變引起酶合成誘導(dǎo)機(jī)制失靈，菌指操縱基因或調(diào)節(jié)基因突變引起酶合成誘導(dǎo)機(jī)制失靈，菌株不經(jīng)誘導(dǎo)也能合成酶、或不受終產(chǎn)物阻遏的調(diào)節(jié)突變型。株不經(jīng)

2、誘導(dǎo)也能合成酶、或不受終產(chǎn)物阻遏的調(diào)節(jié)突變型。l調(diào)節(jié)基因突變，致使不能形成活性化的阻抑物；調(diào)節(jié)基因突變，致使不能形成活性化的阻抑物；l操縱基因突變，喪失和阻抑物結(jié)合的親和力。操縱基因突變，喪失和阻抑物結(jié)合的親和力。 因此，可以利用一些易同化碳源或價(jià)廉易得的碳源作為基質(zhì)生產(chǎn)所因此，可以利用一些易同化碳源或價(jià)廉易得的碳源作為基質(zhì)生產(chǎn)所需的誘導(dǎo)酶類。需的誘導(dǎo)酶類。l2. 2. 篩選方法及實(shí)例篩選方法及實(shí)例l(1) (1) 限量誘導(dǎo)物恒化培養(yǎng)限量誘導(dǎo)物恒化培養(yǎng)l(2) (2) 循環(huán)培養(yǎng)循環(huán)培養(yǎng)l(3) (3) 鑒別性培養(yǎng)基的利用鑒別性培養(yǎng)基的利用l(4) (4) 篩選篩選4.1 4.1 組成型突變株的

3、選育組成型突變株的選育 (1) (1) 限量誘導(dǎo)物恒化培養(yǎng)限量誘導(dǎo)物恒化培養(yǎng)將野生型菌種經(jīng)誘變后移接到低濃度將野生型菌種經(jīng)誘變后移接到低濃度誘導(dǎo)物的恒化器中連續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)物的恒化器中連續(xù)培養(yǎng)由于底物濃度低到對(duì)野由于底物濃度低到對(duì)野生型不發(fā)生誘導(dǎo)作用，生型不發(fā)生誘導(dǎo)作用，所以誘導(dǎo)型的野生菌不所以誘導(dǎo)型的野生菌不能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)突變株由于不經(jīng)誘導(dǎo)即突變株由于不經(jīng)誘導(dǎo)即可產(chǎn)生誘導(dǎo)酶而利用底可產(chǎn)生誘導(dǎo)酶而利用底物，因而得以生長(zhǎng)成為物，因而得以生長(zhǎng)成為組成型菌株組成型菌株4.1 4.1 組成型突變株的選育組成型突變株的選育2. 2. 篩選方法及實(shí)例篩選方法及實(shí)例 (2) (2) 循環(huán)培養(yǎng)循環(huán)培養(yǎng)含有誘導(dǎo)物含有

4、誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基不含誘導(dǎo)物不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基交替連續(xù)循環(huán)培養(yǎng)交替連續(xù)循環(huán)培養(yǎng)由于組成型突變株在兩種培養(yǎng)基上由于組成型突變株在兩種培養(yǎng)基上都能產(chǎn)酶，生長(zhǎng)逐漸占優(yōu)勢(shì)都能產(chǎn)酶，生長(zhǎng)逐漸占優(yōu)勢(shì)4.1 4.1 組成型突變株的選育組成型突變株的選育2. 2. 篩選方法及實(shí)例篩選方法及實(shí)例(3) (3) 鑒別性培養(yǎng)基的利用鑒別性培養(yǎng)基的利用甘油作惟一甘油作惟一碳源碳源涂布誘涂布誘變孢子變孢子懸液懸液噴上噴上O-O-硝基苯酚硝基苯酚- -D-D-半乳糖苷半乳糖苷(ONPG)(ONPG)組成型組成型誘導(dǎo)型誘導(dǎo)型4.1 4.1 組成型突變株的選育組成型突變株的選育2. 2. 篩選方法及實(shí)例篩選方法及

5、實(shí)例 (4) (4) 篩選篩選l經(jīng)誘變劑處理后的菌體移接到含有誘導(dǎo)能力低，但能作經(jīng)誘變劑處理后的菌體移接到含有誘導(dǎo)能力低，但能作為良好碳源的誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，突變體能良好生為良好碳源的誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，突變體能良好生長(zhǎng)，野生型不能生長(zhǎng)。長(zhǎng)，野生型不能生長(zhǎng)。l例如：利用苯例如：利用苯-半乳糖半乳糖(PG)(PG)篩選篩選-半乳糖苷酶組成型突變半乳糖苷酶組成型突變株。株。4.1 4.1 組成型突變株的選育組成型突變株的選育2. 2. 篩選方法及實(shí)例篩選方法及實(shí)例l概念：概念：抗分解阻遏和抗分解抑制的突變株?？狗纸庾瓒艉涂狗纸庖种频耐蛔冎辍分解代謝阻遏現(xiàn)象：分解代謝阻遏現(xiàn)象：在初級(jí)或次級(jí)代

6、謝中都存在，其含義在初級(jí)或次級(jí)代謝中都存在，其含義是指代謝過(guò)程中酶的合成往往受高濃度的葡萄糖或其他易是指代謝過(guò)程中酶的合成往往受高濃度的葡萄糖或其他易分解利用的碳源或氮源所抑制。分解利用的碳源或氮源所抑制。l選育抗分解調(diào)節(jié)突變株選育抗分解調(diào)節(jié)突變株( (如碳源、氮源或磷酸鹽分解調(diào)節(jié)如碳源、氮源或磷酸鹽分解調(diào)節(jié)) )，其實(shí)就是篩選合成酶的產(chǎn)生不受碳、氮、磷的代謝阻遏或其實(shí)就是篩選合成酶的產(chǎn)生不受碳、氮、磷的代謝阻遏或抑制的突變株，使抗生素提前到菌體生長(zhǎng)期開始合成，延抑制的突變株，使抗生素提前到菌體生長(zhǎng)期開始合成，延長(zhǎng)產(chǎn)抗期以提高產(chǎn)量。長(zhǎng)產(chǎn)抗期以提高產(chǎn)量。4.2 4.2 抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育抗分

7、解調(diào)節(jié)突變株的選育二、抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育抗分解阻遏、抗分解抑制（一）解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育（二）氮源（三）磷酸鹽 篩選此類突變株的目的篩選此類突變株的目的由于葡萄糖分解產(chǎn)物的積累，阻遏抗生素合成的關(guān)鍵酶，從而抑由于葡萄糖分解產(chǎn)物的積累，阻遏抗生素合成的關(guān)鍵酶，從而抑制抗生素的合成。在實(shí)際生產(chǎn)中，采用流加葡萄糖或應(yīng)用混合碳制抗生素的合成。在實(shí)際生產(chǎn)中，采用流加葡萄糖或應(yīng)用混合碳源可以控制分解中間產(chǎn)物的累積來(lái)減少不利影響，但最根本的辦源可以控制分解中間產(chǎn)物的累積來(lái)減少不利影響，但最根本的辦法則是篩選抗碳源分解調(diào)節(jié)突變株，以解除上述調(diào)節(jié)機(jī)制，達(dá)到法則是篩選抗碳源分解調(diào)節(jié)突變株，以解除上述調(diào)節(jié)機(jī)

8、制，達(dá)到增產(chǎn)的目的。增產(chǎn)的目的。 篩選方法與實(shí)例篩選方法與實(shí)例(1) (1) 循環(huán)培養(yǎng)法循環(huán)培養(yǎng)法(2) (2) 鑒別性培養(yǎng)基鑒別性培養(yǎng)基(3) (3) 特殊氮源特殊氮源(4) (4) 葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物4.2 4.2 抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育1. 1. 解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育(1) (1) 循環(huán)培養(yǎng)法循環(huán)培養(yǎng)法快速利用的快速利用的碳源培養(yǎng)基碳源培養(yǎng)基慢速利用的慢速利用的碳源培養(yǎng)基碳源培養(yǎng)基交替培養(yǎng)交替培養(yǎng)突變型解除了阻遏現(xiàn)象，在乳糖的突變型解除了阻遏現(xiàn)象，在乳糖的培養(yǎng)基上比野生型生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)基上比野生型生長(zhǎng)速度快，4.2 4.2

9、 抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育1. 1. 解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育(2) (2) 鑒別性培養(yǎng)基鑒別性培養(yǎng)基含有葡萄糖含有葡萄糖的瓊脂平板的瓊脂平板涂布誘涂布誘變后的變后的菌體菌體噴上噴上O-O-硝基苯酚硝基苯酚- -D-D-半乳糖苷半乳糖苷(ONPG)(ONPG)突變型突變型野生型野生型4.2 4.2 抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育1. 1. 解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育(3) (3) 特殊氮源特殊氮源l用葡萄糖為碳源，受阻遏酶的底物作為惟一氮源用葡萄糖為碳源，受阻遏酶的底物作為惟一氮源配制成培養(yǎng)基，連續(xù)移接誘變后的產(chǎn)氣

10、桿菌配制成培養(yǎng)基，連續(xù)移接誘變后的產(chǎn)氣桿菌( (Aerobacters aerogenesAerobacters aerogenes) )，可以篩選出不受葡，可以篩選出不受葡萄糖阻遏的組氨酸酶突變株。萄糖阻遏的組氨酸酶突變株。4.2 4.2 抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育1. 1. 解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育(4) (4) 葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物l 特性：特性：2-dG2-dG和和3-mG3-mG既不被微生物代謝又具有分解阻遏作用，既不被微生物代謝又具有分解阻遏作用，因此可用來(lái)篩選抗分解阻遏的突變株。因此可用來(lái)篩選抗分解阻遏的突變株。2-dG3-m

11、G4.2 4.2 抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育1. 1. 解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育4.葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物-（1）篩選方法涂瓊脂平板出發(fā)菌株誘變抗2-dG或3-mG菌落優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)低濃度2-dG或3-mG一種特殊碳源經(jīng)誘導(dǎo)酶水解才能利用野生型菌株淘汰l 篩選方法篩選方法l培養(yǎng)基要求含低濃度培養(yǎng)基要求含低濃度2-dG2-dG或或3-mG3-mG及一種生長(zhǎng)碳源，該碳源必須經(jīng)相及一種生長(zhǎng)碳源，該碳源必須經(jīng)相應(yīng)的誘導(dǎo)酶水解才能被微生物同化利用。應(yīng)的誘導(dǎo)酶水解才能被微生物同化利用。l 抗性突變株的性質(zhì)抗性突變株的性質(zhì)l應(yīng)用應(yīng)用2-dG2-dG或或3-mG3-mG不僅可以定

12、向選育分解阻遏脫敏突變株，也可有效不僅可以定向選育分解阻遏脫敏突變株，也可有效地分離到高產(chǎn)菌株。地分離到高產(chǎn)菌株。4.2 4.2 抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育1. 1. 解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育(4) (4) 葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物葡萄糖結(jié)構(gòu)類似物2. 2. 解除氮源分解調(diào)節(jié)突變株的選育解除氮源分解調(diào)節(jié)突變株的選育l氮源分解調(diào)節(jié)：氮源分解調(diào)節(jié)：指含氮產(chǎn)物的酶受快速利用的氮源阻遏。指含氮產(chǎn)物的酶受快速利用的氮源阻遏。l類型：類型：細(xì)菌、酵母、霉菌等微生物對(duì)細(xì)菌、酵母、霉菌等微生物對(duì)初級(jí)代謝初級(jí)代謝產(chǎn)物的氮降產(chǎn)物的氮降解物具有調(diào)節(jié)作用。解物具有調(diào)節(jié)作用。次級(jí)代謝次

13、級(jí)代謝的氮降解物的阻遏主要指銨的氮降解物的阻遏主要指銨鹽和其他快速利用的氮源對(duì)抗生素生物合成具有分解調(diào)節(jié)鹽和其他快速利用的氮源對(duì)抗生素生物合成具有分解調(diào)節(jié)作用。作用。l實(shí)例：實(shí)例：篩選芽孢桿菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶產(chǎn)量篩選芽孢桿菌中耐氨基酸菌株，是提高蛋白酶產(chǎn)量的一種有效方法。的一種有效方法。4.2 4.2 抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育二、抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育（三）解除磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株的選育初級(jí)代謝必須過(guò)量時(shí)影響次級(jí)代謝磷酸鹽基本耗竭，抗生素合成開始發(fā)酵工業(yè)中，磷酸鹽常被控制在亞適量。3. 3. 解除磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株的選育解除磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株的選育（A A）磷酸鹽對(duì)次生

14、產(chǎn)物的調(diào)節(jié)機(jī)制）磷酸鹽對(duì)次生產(chǎn)物的調(diào)節(jié)機(jī)制(1) (1) 通過(guò)初級(jí)代謝的變化影響次級(jí)代謝通過(guò)初級(jí)代謝的變化影響次級(jí)代謝 加強(qiáng)初級(jí)代謝，推遲抗生素合成的起始；加強(qiáng)初級(jí)代謝，推遲抗生素合成的起始； 改變糖類分解代謝途徑，磷酸鹽有利于糖酵解，從而改變糖類分解代謝途徑，磷酸鹽有利于糖酵解，從而降低戊糖途徑的活力，導(dǎo)致某些以戊糖途徑為先導(dǎo)的抗生降低戊糖途徑的活力，導(dǎo)致某些以戊糖途徑為先導(dǎo)的抗生素合成受抑制；素合成受抑制； 限制抗生素合成的誘導(dǎo)物；限制抗生素合成的誘導(dǎo)物； 抑制或阻遏磷酸脂酶類的合成。抑制或阻遏磷酸脂酶類的合成。(2) (2) 磷酸鹽對(duì)磷酸鹽對(duì)ATPATP調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)：磷酸鹽可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞

15、內(nèi)的效應(yīng)磷酸鹽可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)物物cAMPcAMP、ATPATP等來(lái)控制抗生素的基因表達(dá)。等來(lái)控制抗生素的基因表達(dá)。4.2 4.2 抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育（B B） 發(fā)酵過(guò)程中對(duì)磷酸鹽的控制發(fā)酵過(guò)程中對(duì)磷酸鹽的控制l其添加濃度要嚴(yán)格限制在亞適量的水平，但最主要的目標(biāo)是選育解其添加濃度要嚴(yán)格限制在亞適量的水平，但最主要的目標(biāo)是選育解除磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株。除磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株。4.2 4.2 抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育3. 3. 解除磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株的選育解除磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株的選育 （C C）抗磷酸突變株）抗磷酸突變株的篩選方法的篩選方法4.2 4.2

16、抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育3. 3. 解除磷酸解除磷酸 鹽調(diào)節(jié)突變株鹽調(diào)節(jié)突變株的選育的選育 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的特性：營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的特性： （1）代謝障礙突變株，由結(jié)構(gòu)基因突變引起合成代謝中一個(gè)酶失活，使某個(gè)生）代謝障礙突變株，由結(jié)構(gòu)基因突變引起合成代謝中一個(gè)酶失活，使某個(gè)生化反應(yīng)發(fā)生遺傳性障礙，使菌株喪失合成某種物質(zhì)的能力，導(dǎo)致該菌株在培養(yǎng)化反應(yīng)發(fā)生遺傳性障礙，使菌株喪失合成某種物質(zhì)的能力，導(dǎo)致該菌株在培養(yǎng)基中不添加這種物質(zhì)就無(wú)法生長(zhǎng)。基中不添加這種物質(zhì)就無(wú)法生長(zhǎng)。 （2）營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株常常會(huì)使發(fā)生障礙的前一步的中間代謝產(chǎn)物得到累積，這）營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株常常會(huì)使發(fā)生障礙的

17、前一步的中間代謝產(chǎn)物得到累積，這就成為利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵來(lái)就成為利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵來(lái)積累有用中間代謝產(chǎn)物積累有用中間代謝產(chǎn)物的依據(jù)。的依據(jù)。 （3）營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株由于生物合成途徑中某一步發(fā)生障礙，合成反應(yīng)不能完成，）營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株由于生物合成途徑中某一步發(fā)生障礙，合成反應(yīng)不能完成，從而從而解除了終產(chǎn)物反饋?zhàn)枰纸獬私K產(chǎn)物反饋?zhàn)枰帧Ｍ饧酉蘖啃枰臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，克服生長(zhǎng)的障礙，使。外加限量需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，克服生長(zhǎng)的障礙，使終產(chǎn)物不至于積累到引起反饋調(diào)節(jié)的濃度，從而有利于中間產(chǎn)物或另一途徑的終產(chǎn)物不至于積累到引起反饋調(diào)節(jié)的濃度，從而有利于中間產(chǎn)物或另一途徑的某種終產(chǎn)物的積累。某種

18、終產(chǎn)物的積累。4.3 4.3 營(yíng)養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用在初級(jí)代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用在初級(jí)代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用（1）直線式生物合成途徑直線式生物合成途徑4.3 4.3 營(yíng)養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用 （2 2） 分支式生分支式生物合成途徑物合成途徑 實(shí)例實(shí)例1 1：谷氨酸谷氨酸棒狀棒狀桿菌的桿菌的L-L-谷氨酸生谷氨酸生物合成途徑物合成途徑生物素缺陷型生物素缺陷型硫胺素缺陷型硫胺素缺陷型4.3 4.3 營(yíng)養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用在初級(jí)代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用在初級(jí)代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用l實(shí)例實(shí)

19、例2 2：谷氨酸棒狀桿菌的腺核苷酸、鳥核苷酸的合成代謝途徑谷氨酸棒狀桿菌的腺核苷酸、鳥核苷酸的合成代謝途徑腺嘌呤缺陷型腺嘌呤缺陷型協(xié)同反饋抑制協(xié)同反饋抑制l實(shí)例實(shí)例3 3 高絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的賴氨酸合成途徑高絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的賴氨酸合成途徑高絲氨酸缺陷型高絲氨酸缺陷型協(xié)同反饋抑制協(xié)同反饋抑制2. 2. 在次級(jí)代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用在次級(jí)代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用（1 1）抗生素增產(chǎn)：）抗生素增產(chǎn)：抗生素產(chǎn)生菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷株多數(shù)生產(chǎn)能力是下抗生素產(chǎn)生菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷株多數(shù)生產(chǎn)能力是下降的。然而，在初級(jí)或次級(jí)代謝產(chǎn)物的分支代謝途徑中，營(yíng)養(yǎng)缺降的。然而，在初級(jí)或次級(jí)代謝產(chǎn)物的分支代謝途徑中，營(yíng)養(yǎng)缺陷型切斷

20、初級(jí)代謝支路，有可能使抗生素增產(chǎn)。陷型切斷初級(jí)代謝支路，有可能使抗生素增產(chǎn)。4.3 4.3 營(yíng)養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用實(shí)例：四環(huán)素、制霉菌素產(chǎn)生菌的脂肪酸缺陷型可增加抗實(shí)例：四環(huán)素、制霉菌素產(chǎn)生菌的脂肪酸缺陷型可增加抗生素。生素。脂肪酸缺陷型脂肪酸缺陷型 （2 2）新產(chǎn)品）新產(chǎn)品 實(shí)例：實(shí)例： 金霉素第六碳原子上甲金霉素第六碳原子上甲基是由蛋氨酸供應(yīng)的，基是由蛋氨酸供應(yīng)的，如果獲得蛋氨酸缺陷型，如果獲得蛋氨酸缺陷型，阻斷了蛋氨酸這一區(qū)段阻斷了蛋氨酸這一區(qū)段的合成，導(dǎo)致次級(jí)代謝的合成，導(dǎo)致次級(jí)代謝中甲基供給受到限制，中甲基供給受到限制，結(jié)果產(chǎn)生去甲基金霉素，

21、結(jié)果產(chǎn)生去甲基金霉素，而不產(chǎn)生金霉素。而不產(chǎn)生金霉素。4.3 4.3 營(yíng)養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用2. 2. 在次級(jí)代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用在次級(jí)代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用四、滲漏缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用滲漏缺陷型：一種特殊的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。遺傳性代謝障礙不完全，酶活力下降而不完全喪失，能在基本培養(yǎng)基上少量生長(zhǎng)選育方法：. 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株接種于基本培養(yǎng)基 平板上 2. 挑菌（生長(zhǎng)特別慢、菌落?。﹍概念：概念：抗反饋調(diào)節(jié)突變株是一種解除合成代謝反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的突變型抗反饋調(diào)節(jié)突變株是一種解除合成代謝反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的突變型菌株。其特點(diǎn)是所需產(chǎn)物不斷積累，不會(huì)因其濃度超量而終止

22、生產(chǎn)：菌株。其特點(diǎn)是所需產(chǎn)物不斷積累，不會(huì)因其濃度超量而終止生產(chǎn)：l如果由于如果由于結(jié)構(gòu)基因突變結(jié)構(gòu)基因突變而使變構(gòu)酶成為不能和代謝終產(chǎn)物相結(jié)合的，便是而使變構(gòu)酶成為不能和代謝終產(chǎn)物相結(jié)合的，便是失去了反饋抑制的突變，稱為失去了反饋抑制的突變，稱為“抗反饋突變型抗反饋突變型”；l如果是由于如果是由于調(diào)節(jié)基因突變調(diào)節(jié)基因突變引起調(diào)節(jié)蛋白不能和代謝終產(chǎn)物相結(jié)合而失去阻引起調(diào)節(jié)蛋白不能和代謝終產(chǎn)物相結(jié)合而失去阻遏作用的，稱為遏作用的，稱為“抗阻遏突變型抗阻遏突變型”。 一般而言，抗阻遏突變結(jié)果使胞內(nèi)酶有可能成倍增長(zhǎng)，而抗反饋突變一般而言，抗阻遏突變結(jié)果使胞內(nèi)酶有可能成倍增長(zhǎng)，而抗反饋突變的胞內(nèi)酶量沒(méi)

23、有什么變化。但從作用效果上講，均造成終產(chǎn)物大量積累，的胞內(nèi)酶量沒(méi)有什么變化。但從作用效果上講，均造成終產(chǎn)物大量積累，而且往往兩種突變同時(shí)發(fā)生，難以區(qū)別。通常就統(tǒng)稱為而且往往兩種突變同時(shí)發(fā)生，難以區(qū)別。通常就統(tǒng)稱為“抗反饋調(diào)節(jié)突變抗反饋調(diào)節(jié)突變型型”。4.5 4.5 抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育l在實(shí)際應(yīng)用在實(shí)際應(yīng)用中，抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育可以通過(guò)以中，抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育可以通過(guò)以下幾個(gè)方面：下幾個(gè)方面：從遺傳上解除反饋調(diào)節(jié)從遺傳上解除反饋調(diào)節(jié) ( (如各種抗性和耐性育種、回復(fù)突如各種抗性和耐性育種、回復(fù)突變子的應(yīng)用等變子的應(yīng)用等) )截流或減少終產(chǎn)物堆積截流或減少終產(chǎn)物堆

24、積 ( (如借助營(yíng)養(yǎng)缺陷型或采用滲漏缺如借助營(yíng)養(yǎng)缺陷型或采用滲漏缺陷型等陷型等) )移去終產(chǎn)物移去終產(chǎn)物 ( (借助膜透性的突變等借助膜透性的突變等) )4.5 4.5 抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株耐自身產(chǎn)物突變株選育耐自身產(chǎn)物突變株選育抗終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育抗終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育累積前體和耐前體突變株的選育累積前體和耐前體突變株的選育4.5 4.5 抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育l1. 1. 概念：概念：一種可逆性突變，即具有突變型基因的個(gè)體通過(guò)再突變又成為野一種可逆性突變，即具有突變型

25、基因的個(gè)體通過(guò)再突變又成為野生型表型的過(guò)程。生型表型的過(guò)程。l2. 2. 產(chǎn)生的原因產(chǎn)生的原因(1) (1) 原有基因的回復(fù)突變?cè)谢虻幕貜?fù)突變：指基因內(nèi)部位點(diǎn)突變引起的逆向突變現(xiàn)象，分以下兩種情況：指基因內(nèi)部位點(diǎn)突變引起的逆向突變現(xiàn)象，分以下兩種情況： 同一基因內(nèi)的同一個(gè)或幾個(gè)堿基的突變引起的回復(fù)，消除了原有突變效應(yīng)，完同一基因內(nèi)的同一個(gè)或幾個(gè)堿基的突變引起的回復(fù)，消除了原有突變效應(yīng)，完全恢復(fù)野生基因型及其功能，即真正的回復(fù)突變；全恢復(fù)野生基因型及其功能，即真正的回復(fù)突變； 在同一基因內(nèi)，但不同的位點(diǎn)堿基的變化，改變了基因的核苷酸序列，補(bǔ)償了在同一基因內(nèi)，但不同的位點(diǎn)堿基的變化，改變了基因

26、的核苷酸序列，補(bǔ)償了原有突變點(diǎn)已失去的功能，使其出現(xiàn)野生表型，稱為基因內(nèi)抑制突變。原有突變點(diǎn)已失去的功能，使其出現(xiàn)野生表型，稱為基因內(nèi)抑制突變。4.5.1 4.5.1 回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株(2) (2) 非原有基因的回復(fù)突變非原有基因的回復(fù)突變l概念：在概念：在DNADNA分子鏈上的一個(gè)基因突變成為突變型，隨后在分子鏈上的一個(gè)基因突變成為突變型，隨后在鄰近的基因某位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，抑制了前一個(gè)突變基因鄰近的基因某位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，抑制了前一個(gè)突變基因的效應(yīng)，重新出現(xiàn)野生型的表型，又稱為的效應(yīng)，重新出現(xiàn)野生型的表型，又稱為抑制基因突變抑制基因突變。4.5.

27、1 4.5.1 回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株2. 2. 產(chǎn)生的原因產(chǎn)生的原因 區(qū)別基因回復(fù)突變和抑制基因突變的方法區(qū)別基因回復(fù)突變和抑制基因突變的方法l將回復(fù)突變菌株和野生型菌株進(jìn)行回交試驗(yàn)或雜交重組將回復(fù)突變菌株和野生型菌株進(jìn)行回交試驗(yàn)或雜交重組試驗(yàn)，觀察它們的子代是否有突變型出現(xiàn)：試驗(yàn)，觀察它們的子代是否有突變型出現(xiàn)： 有同樣的突變型重新出現(xiàn)，說(shuō)明回復(fù)突變和原來(lái)突變型不在有同樣的突變型重新出現(xiàn)，說(shuō)明回復(fù)突變和原來(lái)突變型不在同一位置而是分開的，屬于抑制基因回復(fù)突變株；同一位置而是分開的，屬于抑制基因回復(fù)突變株； 如果雜交后代沒(méi)有產(chǎn)生突變型，表明回復(fù)突變的位置與

28、原突如果雜交后代沒(méi)有產(chǎn)生突變型，表明回復(fù)突變的位置與原突變型位點(diǎn)相同，是真正的回復(fù)突變。變型位點(diǎn)相同，是真正的回復(fù)突變。4.5.1 4.5.1 回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株3. 3. 回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株的篩選回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株的篩選 l(1) (1) 初級(jí)代謝途徑障礙性回復(fù)突變型初級(jí)代謝途徑障礙性回復(fù)突變型l采用回復(fù)突變方法來(lái)篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株是根據(jù)采用回復(fù)突變方法來(lái)篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株是根據(jù)“原養(yǎng)型原養(yǎng)型營(yíng)營(yíng)缺型缺型原養(yǎng)型原養(yǎng)型”選育途徑進(jìn)行的。二次突變后的情況有以下兩種：選育途徑進(jìn)行的。二次突變后的情況有以下兩種： 一種是在原位點(diǎn)發(fā)

29、生回復(fù)突變，恢復(fù)野生型酶活力；一種是在原位點(diǎn)發(fā)生回復(fù)突變，恢復(fù)野生型酶活力； 另一種是在原突變位點(diǎn)以外位置回復(fù)突變。這種回復(fù)突變體的表型另一種是在原突變位點(diǎn)以外位置回復(fù)突變。這種回復(fù)突變體的表型雖然與原養(yǎng)型相似，但基因型不同，它并不是原有結(jié)構(gòu)基因的恢復(fù)，而雖然與原養(yǎng)型相似，但基因型不同，它并不是原有結(jié)構(gòu)基因的恢復(fù)，而是是反饋調(diào)節(jié)變構(gòu)酶的調(diào)節(jié)中心發(fā)生突變反饋調(diào)節(jié)變構(gòu)酶的調(diào)節(jié)中心發(fā)生突變?cè)斐?。突變后的調(diào)節(jié)中心與活性造成。突變后的調(diào)節(jié)中心與活性中心相互影響，催化位點(diǎn)得以恢復(fù)酶活力，由于調(diào)節(jié)位點(diǎn)已發(fā)生突變，中心相互影響，催化位點(diǎn)得以恢復(fù)酶活力，由于調(diào)節(jié)位點(diǎn)已發(fā)生突變，它不能再和阻遏物結(jié)合，因此，它不能

30、再和阻遏物結(jié)合，因此，回復(fù)突變解除了反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，使有效回復(fù)突變解除了反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，使有效代謝產(chǎn)物大量累積代謝產(chǎn)物大量累積。4.5.1 4.5.1 回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株 (2) (2) 次級(jí)代謝途徑障礙性的回復(fù)突變次級(jí)代謝途徑障礙性的回復(fù)突變l次級(jí)代謝回復(fù)突變，是一種初級(jí)代謝途徑或次級(jí)代謝途徑障礙性回復(fù)突變次級(jí)代謝回復(fù)突變，是一種初級(jí)代謝途徑或次級(jí)代謝途徑障礙性回復(fù)突變型。例如金霉素回復(fù)突變就是利用型。例如金霉素回復(fù)突變就是利用“原養(yǎng)型原養(yǎng)型營(yíng)缺型營(yíng)缺型原養(yǎng)型原養(yǎng)型”選育途徑選育途徑進(jìn)行的，獲得了增產(chǎn)。進(jìn)行的，獲得了增產(chǎn)。l除放線菌外，真核微生物獲得高活

31、性的回復(fù)突變的例子不多。除放線菌外，真核微生物獲得高活性的回復(fù)突變的例子不多。l回復(fù)突變的選育途徑也可以應(yīng)用回復(fù)突變的選育途徑也可以應(yīng)用“零變株零變株”的回復(fù)突變型來(lái)達(dá)到超產(chǎn)目的。的回復(fù)突變型來(lái)達(dá)到超產(chǎn)目的?！傲阕冎炅阕冎辍敝竿耆ギa(chǎn)生抗生素能力的突變株；指完全失去產(chǎn)生抗生素能力的突變株；選育途徑是：原養(yǎng)型選育途徑是：原養(yǎng)型零變株零變株回復(fù)突變型?；貜?fù)突變型?！傲阃蛔兞阃蛔儭笨梢园l(fā)生在初級(jí)代謝，也可以發(fā)生在次生代謝途徑中，總之是失去了產(chǎn)可以發(fā)生在初級(jí)代謝，也可以發(fā)生在次生代謝途徑中，總之是失去了產(chǎn)量的代謝障礙突變。量的代謝障礙突變。“零變株零變株”的回復(fù)突變株的篩選的回復(fù)突變株的篩選4.5.

32、1 4.5.1 回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株3. 3. 回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株的篩選回復(fù)突變引起的抗反饋調(diào)節(jié)突變株的篩選l發(fā)生障礙性突變的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，抗生素產(chǎn)量大多數(shù)都比發(fā)生障礙性突變的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，抗生素產(chǎn)量大多數(shù)都比親株低，而回復(fù)突變株往往比原養(yǎng)型親株高。原因在于：親株低，而回復(fù)突變株往往比原養(yǎng)型親株高。原因在于：lA. A. 缺陷型菌株缺陷型菌株中幾種不能合成的氨基酸都是參與相應(yīng)抗生素生中幾種不能合成的氨基酸都是參與相應(yīng)抗生素生物合成的，基因突變的結(jié)果是使菌體喪失參與合成這些氨基酸的物合成的，基因突變的結(jié)果是使菌體喪失參與合成這些氨基酸的酶活力，導(dǎo)致

33、有關(guān)抗生素合成過(guò)程因缺乏氨基酸而產(chǎn)量下降。酶活力，導(dǎo)致有關(guān)抗生素合成過(guò)程因缺乏氨基酸而產(chǎn)量下降。lB. B. 回復(fù)突變回復(fù)突變除原變異位點(diǎn)發(fā)生逆轉(zhuǎn)突變而使野生型基因重建以除原變異位點(diǎn)發(fā)生逆轉(zhuǎn)突變而使野生型基因重建以外，有時(shí)還會(huì)發(fā)生原突變位點(diǎn)以外的基因內(nèi)抑制或抑制基因突變。外，有時(shí)還會(huì)發(fā)生原突變位點(diǎn)以外的基因內(nèi)抑制或抑制基因突變。l自身代謝產(chǎn)物，包括初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物。自身代謝產(chǎn)物，包括初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物。微生物控制初級(jí)代謝產(chǎn)物的反饋機(jī)制相當(dāng)嚴(yán)格；微生物控制初級(jí)代謝產(chǎn)物的反饋機(jī)制相當(dāng)嚴(yán)格；對(duì)次生產(chǎn)物，反饋調(diào)節(jié)機(jī)制也起重要作用。對(duì)次生產(chǎn)物，反饋調(diào)節(jié)機(jī)制也起重要作用。 要使這些產(chǎn)物適

34、量生產(chǎn)，必須繞過(guò)這些調(diào)節(jié)機(jī)制。要使這些產(chǎn)物適量生產(chǎn)，必須繞過(guò)這些調(diào)節(jié)機(jī)制。l一個(gè)菌株的生產(chǎn)能力與耐自身抗生素的濃度是成正相關(guān)的?？棺砸粋€(gè)菌株的生產(chǎn)能力與耐自身抗生素的濃度是成正相關(guān)的?？棺陨懋a(chǎn)物能力是高產(chǎn)菌株的特性之一。身產(chǎn)物能力是高產(chǎn)菌株的特性之一。l除耐自身產(chǎn)物之外，還可以考慮與以下情況結(jié)合進(jìn)行：除耐自身產(chǎn)物之外，還可以考慮與以下情況結(jié)合進(jìn)行：第一，抗第一，抗Mg Mg 2 2離子突變離子突變第二，許多抗生素的鈍化酶已知作為選擇性標(biāo)記，設(shè)想篩選第二，許多抗生素的鈍化酶已知作為選擇性標(biāo)記，設(shè)想篩選高活性鈍化高活性鈍化酶的變株酶的變株，其自身耐性亦會(huì)提高。，其自身耐性亦會(huì)提高。鈍化酶：又稱合成

35、酶，可催化某些基團(tuán)結(jié)合到抗生素的鈍化酶：又稱合成酶，可催化某些基團(tuán)結(jié)合到抗生素的OHOH基或基或NHNH2 2基上，基上，使抗生素失活。使抗生素失活。 4.5.2 4.5.2 耐自身產(chǎn)物突變株選育耐自身產(chǎn)物突變株選育l1. 1. 結(jié)構(gòu)類似物結(jié)構(gòu)類似物是指那些在結(jié)構(gòu)上和代謝終產(chǎn)物是指那些在結(jié)構(gòu)上和代謝終產(chǎn)物( (氨基酸、嘌呤、維生素等氨基酸、嘌呤、維生素等) )相似的物相似的物質(zhì)。它們和終產(chǎn)物一樣能夠和變構(gòu)酶的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，起共遏物作用，用酶變構(gòu)引起質(zhì)。它們和終產(chǎn)物一樣能夠和變構(gòu)酶的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，起共遏物作用，用酶變構(gòu)引起反饋?zhàn)枰郑凰煌氖?，終產(chǎn)物與酶結(jié)合是可逆的，而類似物由于不真正摻入細(xì)胞結(jié)

36、反饋?zhàn)枰?；所不同的是，終產(chǎn)物與酶結(jié)合是可逆的，而類似物由于不真正摻入細(xì)胞結(jié)構(gòu)，酶活性不會(huì)恢復(fù)，因而是構(gòu)，酶活性不會(huì)恢復(fù)，因而是“假反饋抑制假反饋抑制”。4.5.3 4.5.3 抗終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育抗終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育l2. 2. 結(jié)構(gòu)類似物對(duì)微生物是結(jié)構(gòu)類似物對(duì)微生物是致死的致死的，它們往往具有抑菌的作用。在含有結(jié)構(gòu)類，它們往往具有抑菌的作用。在含有結(jié)構(gòu)類似物的培養(yǎng)基上野生型是不能生長(zhǎng)，然而抗結(jié)構(gòu)類似物的變株則能生長(zhǎng)。似物的培養(yǎng)基上野生型是不能生長(zhǎng)，然而抗結(jié)構(gòu)類似物的變株則能生長(zhǎng)。l3. 3. 抗代謝結(jié)構(gòu)類似物育種是最早采用并取得顯著成效的代謝育種方法，成為抗代謝結(jié)構(gòu)類似物

37、育種是最早采用并取得顯著成效的代謝育種方法，成為當(dāng)今初級(jí)代謝產(chǎn)物，尤其是氨基酸產(chǎn)生菌育種的主流。較之營(yíng)養(yǎng)缺陷型的方當(dāng)今初級(jí)代謝產(chǎn)物，尤其是氨基酸產(chǎn)生菌育種的主流。較之營(yíng)養(yǎng)缺陷型的方法，它具有以下法，它具有以下優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：l(1) (1) 如果找到適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)類似物，用此種選育法簡(jiǎn)單易行且效果顯著；如果找到適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)類似物，用此種選育法簡(jiǎn)單易行且效果顯著；l(2) (2) 采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵，解除代謝調(diào)節(jié)是通過(guò)控制培養(yǎng)基中所需營(yíng)養(yǎng)采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵，解除代謝調(diào)節(jié)是通過(guò)控制培養(yǎng)基中所需營(yíng)養(yǎng)物濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)，并沒(méi)有從遺傳上根本解除代謝調(diào)節(jié)，所需營(yíng)養(yǎng)物的量不易控物濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)，并沒(méi)有從遺傳上根本解除代謝

38、調(diào)節(jié)，所需營(yíng)養(yǎng)物的量不易控制，造成代謝產(chǎn)物不穩(wěn)定；而抗結(jié)構(gòu)類似物變株的代謝調(diào)節(jié)被解除，生產(chǎn)操制，造成代謝產(chǎn)物不穩(wěn)定；而抗結(jié)構(gòu)類似物變株的代謝調(diào)節(jié)被解除，生產(chǎn)操作方便，產(chǎn)量穩(wěn)定；作方便，產(chǎn)量穩(wěn)定；l(3) (3) 突變株易于保存，而且不發(fā)生回復(fù)突變，只要在保存培養(yǎng)基中加入適量突變株易于保存，而且不發(fā)生回復(fù)突變，只要在保存培養(yǎng)基中加入適量結(jié)構(gòu)類似物，即可防止回復(fù)突變。結(jié)構(gòu)類似物，即可防止回復(fù)突變。4.5.3 4.5.3 抗終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育抗終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育l4. 4. 選育實(shí)例選育實(shí)例l(1) (1) 直線合成途徑直線合成途徑l利用抗結(jié)構(gòu)類似物的方法，可以直接累積終產(chǎn)物。如抗刀豆氨酸的突利用抗結(jié)構(gòu)類似物的方法，可以直接累積終產(chǎn)物。如抗刀豆氨酸的突變株變株AIRAIR，可有效地積累精氨酸。，可有效地