免疫組化操作方法、原理、步驟以及常見問題處理大總結(jié)0001

1、免疫組化操作方法、原理、步驟以及常見問題處理大總結(jié)1、方法操作不難,最大的難處是出現(xiàn)異常結(jié)果時如何解決這就需要掌握免疫組化實 驗原理,每一步知道為什么這樣做,這樣你才敢大膽地改革先前的不對的方法步驟.如抗體孵育條件主要是抗體濃度、溫度、時間,這三者一般是相互成反比的相對,其中濃度是 最重要的先決條件,溫度決定反響的速度、時間決定反響的量.就拿溫度來說,可以有4度、室溫、37度,我推薦4度最正確,反響最溫和,背景較淺；而37度反響速度較快,時間較短；室溫我不太提倡,除非你每次都把環(huán)境溫度限制在一定的范圍,否那么,盡量選擇前兩者. 2、免疫組化最大的優(yōu)勢是定位和定性.相比于其他蛋白檢測方法,免疫組

2、化具有定性靈敏度高、定位較直接準確,是定位檢測分析首選方法.尤其對于有些因子的轉(zhuǎn)位研究十分有用.3、免疫組化結(jié)果定量分析的前提是高質(zhì)量的染色切片.免疫組化結(jié)果也能定量分析,但必須是背景染色淺而特異性染色較深的情況下,分析最為準確,這種原那么可能也是我們?nèi)粘徃鍟r判定研究結(jié)果的必備條件.4、免疫組化實驗一定要設(shè)置陽性對照和陰性對照.陽性對照一般是用肯定表達這種抗原的切片來做；陰性對照一般是用 PBS或非一抗替代一抗來進行反響,其余步驟均一致. 前者是排除方法和實驗系統(tǒng)有無問題；后者是排除有無一抗外的非特異性染色.5、免疫組化的應(yīng)用廣泛,是當(dāng)前實驗研究的最重要方法之一. 如今發(fā)SCI論文時, 明顯

3、感覺僅靠量化的數(shù)據(jù)來發(fā)文章很難, 加一些形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)或圖片, 老外十分歡送,可能是 怕你學(xué)術(shù)造假吧.當(dāng)然也不能做假陽性或假陰性結(jié)果.6、免疫組化技術(shù)掌握與否的鑒定標(biāo)準是同一切片或不同切片中不同抗原均從摸索 濃度或條件而做出優(yōu)良的染色切片.我在平時帶教中就發(fā)現(xiàn)許多研究生把我已經(jīng)摸索很成熟的反響條件、濃度、方法步驟,重復(fù)運用于同一性質(zhì)的切片和同一種抗體,做出來后就覺得自己已經(jīng)掌握了免疫組化方法,更換一種抗體后,居然連二抗的種屬來源都拿錯了.失敗往往促進你去思測試驗原理和過程,成功有時也加快你自傲.7、實驗方法需要動手+動腦.如今我還不敢說我在免疫組化什么都知道.我只所以今天敢在這里說這說那,這是由于

4、我經(jīng)過了反復(fù)的動手+動腦,把理論原理運用于實踐,在把實踐中發(fā)現(xiàn)的問題帶到理論知識中去解決,最終把理論與實踐融會貫穿. 一、概念和常用方法介紹1、定義用標(biāo)記的特異性抗體對組織切片或細胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量 進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究,這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)immunohistochemistry 技術(shù)或免疫細胞化學(xué) immunocytochemistry 技術(shù).2、原理 根據(jù)抗原抗體反響和化學(xué)顯色原理,組織切片或細胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合,再利用一抗與標(biāo)記生物素、熒光素等的二抗進行反響,前者再用標(biāo)記辣根過氧化物 酶HRP或堿性磷酸酶AKR等的抗生物素如鏈霉親和素等結(jié)合,

5、最后通過呈色反響 或熒光來顯示細胞或組織中化學(xué)成分,在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清楚看見細胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反響產(chǎn)物,從而能夠在細胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含 量.3、分類1 按標(biāo)記物質(zhì)的種類,如熒光染料、放射性同位素、酶主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶、鐵蛋白、膠體金等,可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶 標(biāo)法和免疫金銀法等.2按染色步驟可分為直接法又稱一步法和間接法二步、三步或多步法.與直接法相比,間接法的靈敏度提升了許多.3按結(jié)合方式可分為抗原-抗體結(jié)合,如過氧化物酶-抗過氧化物酶PAR法；親和連接,如卵白素-生物素-過氧化物 酶復(fù)合物AB.法、鏈霉菌抗生物素蛋白-

6、過氧化物酶連結(jié)SP法等,其中SP法是比擬常用的方法；聚合物鏈接,如即用型二步法,此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織 抗原檢測.4、目前幾種常用免疫組化方法簡單介紹1 免疫熒光方法是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù).它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理,先將抗體標(biāo)上熒光素,以此作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原,在熒光顯微鏡下觀察. 當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光,從而可確定組織中某種抗原的定位,進而還可進行定量分析.由于免疫熒光技術(shù)特異性強、靈敏度高、快速簡便,所以在臨床病理診斷、檢驗 中應(yīng)用較廣.2免疫酶標(biāo)方法免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后,于60年代開展起來的技術(shù).

7、根本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細胞作用,然后參加酶的底物,生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒,通過光鏡或電鏡,對細胞外表和細胞內(nèi)的各種抗原成分進行定位研究.免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前最常用的技術(shù).本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點是：定位準確,對比度好,染色標(biāo)本可長期保存,適合于光、電鏡研究等.免疫酶標(biāo)方法的開展非常迅速,已 經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法, 且隨著方法的不斷改良和創(chuàng)新, 其特異性和靈敏度都在不斷提升, 使用也越來越方便.目前在病理診斷中廣為使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法檢測系統(tǒng)等.3免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物.膠體 金是指

8、金的水溶膠,它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白,對蛋白的生物學(xué)活性那么沒有明顯的影響. 因此,用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子如葡萄球菌A蛋白等作為探針,就能對組織或細胞內(nèi)的抗原進行定性、定位,甚至定量研究.由于膠體金有不 同大小的顆粒,且膠體金的電子密度高, 所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記 或多標(biāo)記定位研究.由于膠體金本身呈淡至深紅色,因此也適合進行光鏡觀察.如應(yīng)用銀加強的免疫金銀法那么更便于光鏡觀察.5、被檢測的物質(zhì)組織或細胞中但凡能作為抗原或半抗原,如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激 素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進行檢測.6、特點1

9、特異性強.免疫學(xué)的根本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性,因此,免疫組化從理論上講也是組織細胞中抗原的特定顯示,如角蛋白keratin 顯示上皮成分,LCA顯示淋巴細胞成分.只有當(dāng)組織細胞中存在交叉抗原時,才會出現(xiàn)交叉 反響.2敏感性高.在應(yīng)用免疫組化的起始階段,由于技術(shù)上的限制,只有直接法、間接 法等敏感性不高的技術(shù),那時的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于ABC法或SP三步法的出現(xiàn),使抗體稀釋上千倍、 上萬倍甚至上億倍仍可在組織細胞中與抗原結(jié)合,這樣高敏感性的抗體抗原反響, 使免疫組化方法越來越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作.3定位準確、形態(tài)與功能相結(jié)合.該技術(shù)通過抗原抗體反響及呈色

10、反響,可在組織和細胞中進行抗原的準確定位,因而可同時對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察,這樣就可以進行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究,對病理學(xué)領(lǐng)域開展深入研究是十分有意義的.7、從蛋白水平檢測角度 ,免疫組化技術(shù)與 Western blotting 、ELISA的異同1 Western blotting :蛋白質(zhì)免疫印跡,也是利用抗體抗原反響原理,結(jié)合化學(xué)發(fā)光等技術(shù)來 檢查組織或細胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測方法.與免疫組化技術(shù)相比,定量可能更加準確；當(dāng)然Western blotting也可定性和定位通過提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白分別檢測其中抗原含量,進而間接反映它們的定位,但敏感性遠遠低于免疫組化

11、技術(shù).2 ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗,也是利用抗體-抗原-抗原結(jié)合反響原理來檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的 檢測.與免疫組化技術(shù)相比,定量最準確,是分泌性蛋白檢測首選方法之一. 二、實驗流程簡介1、SP三步法1石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水.2彼3%H2O及離子水無色液體明育10-30分鐘,以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性.3蒸儲水沖洗,PBS受?包5分鐘4候選步驟：采用抗原修復(fù)：微波建 議30分鐘內(nèi)4次中火、高壓、酶修復(fù)方法.自然冷卻,再用 3分鐘X 3次.5血清封閉： 室溫15-30分鐘,盡可能與二抗來源一致. 傾去,勿洗.6 滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗,37 C 孵育23小時或4c過夜最好復(fù)溫.PBS沖

12、洗,3分鐘X 5次.7滴加生物素標(biāo)記的二抗,室溫或37c孵育30分鐘-1h.8 PBS沖洗,3分鐘X 5次.9滴加SP 鏈霉親和素- 過氧化物酶,室溫或 37 c孵育30分鐘-1h.10 PBS沖洗,3分鐘X 5次.11顯色劑顯 色DA睹.12自來水充分沖洗.13可進行復(fù)染,脫水,透明.14選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?2、即用型二步法1 脫蠟、水化組織切片. 2根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求,對組織切片進彳T預(yù)處理.3麻3%H2O去離子水孵育5分鐘-30分鐘,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,PBS或TBS沖洗.4滴加一抗,室溫或 37c孵育3060分鐘,或4c過夜,PBS 或TBS浸洗3分鐘X 5次.5滴加en

13、hangcer增強劑,37度30min, PBS或TBS浸洗3分鐘 X5次.6滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體,室溫/37 C孵育30分鐘-1h, PBS/TBS 沖洗,3分鐘X 5次.7應(yīng)用DAB§液顯色.8蒸儲水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片. 三、免疫熒光技術(shù)1、免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)1 冰凍切片制備：建議用新鮮組織,否那么組織細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞,易使抗原彌散.選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等,預(yù)防裂 片和脫片嚴重.2組織切片固定：切好片風(fēng)干后立即用冰西奈山環(huán)保組織固定液固定5-10min ,尤其要較長時間保存的白片,一定要及時固定和適當(dāng)保存.3血清封閉：為預(yù)

14、防內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合,需要在一抗孵育前先用血清與二抗來源一致 封閉,減弱背景著色.血清封閉的時間是可以調(diào)整的,一般 10-30min.4 一抗孵育條件：在免疫組 化反響中最重要,包括孵育時間和抗體濃度.一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度,其中4度效果最正確；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān),一般 37度1-2h ,而4度過夜和從 冰箱拿出后37度復(fù)溫45min.具體條件還要摸索.5二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h,具體時間需要摸索,而濃度一般有工作液,假設(shè)是濃縮液還要摸索濃度,切記 要避光反響.但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下,然后去摸索一抗?jié)?/p>

15、度和孵育時間.最后,熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時間的延長,可能后有大量的游離熒光素殘留,需要注意配制時小包裝和并進行適當(dāng)?shù)碾x心.6復(fù)染：目的是形成細胞輪廓,從而更好地對目標(biāo)蛋白進行定位.一般常用DAPI復(fù)染.7封片：為了長期保存,我們一般用緩沖甘油等封片,此外還有專門的抗熒光萃滅封片液.預(yù)防產(chǎn)生氣泡,方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液, 然后一手拿住蓋片某一拐角,而另一手拿對面的那個拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接觸到液體時為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時,那么可以緩慢降低另一拐角,這樣一般不會產(chǎn)生氣泡.8切片清洗：為了預(yù)防一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,所以適當(dāng)?shù)卦鰪娗逑囱?/p>

16、長時間和增屢次數(shù)尤為重要,我一般在一抗 孵育前的清洗是3min*3次,而一抗孵育后的清洗均為5次*5min.注意1單獨沖洗,防止交叉反響造成污染.2溫柔沖洗,預(yù)防切片的脫落.我喜歡用浸洗方式；3沖洗的時間要足夠,才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì).4 PBS的PH和離子強度的使用和要求.這方面我有慘痛教訓(xùn),當(dāng)時我買的抗體稀釋液偏酸,結(jié)果背景一片黃未見特異性染色,建議 PH在濃度是.中性及弱磴性條件PH7-8有利于免疫復(fù)合物的形成,而酸性條件那么有利于分解；低離子強度有利于免疫復(fù)合物的形成,而高離子強度那么有利于分解9拍照：有條件的話最好立即拍照,假設(shè)不能及時拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和濕度.

17、 使用熒光顯微鏡注意嚴格根據(jù)熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作,不要隨意改變程序；應(yīng)在暗室中進行檢查；預(yù)防紫外線對眼睛的損害,在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡；檢查時間每 次以12h為宜,超過90min,超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降,熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照 射35min后,熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長時間的照射,會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn) 象；所以最多不得超過 23h;熒光顯微鏡光源壽命有限,標(biāo)本應(yīng)集中檢查,以節(jié)省時間, 保護光源.天熱時,應(yīng)加電扇散熱降溫, 新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時間.燈熄滅后欲再 啟用時,須待燈光充分冷卻后才能點燃.一天中應(yīng)預(yù)防數(shù)次點燃光源.關(guān)閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后；

18、標(biāo)本染色后立即觀察,因時間久了熒光會逐漸減弱.假設(shè)將標(biāo)本放在聚乙烯塑 料袋中4 c保存,可延緩熒光減弱時間,預(yù)防封裱劑蒸發(fā)；使用的玻片等載體,都必須厚度 均勻,無明顯的自發(fā)熒光,如果使用油鏡,還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩(wěn)壓器,否那么電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命,也會影響鏡檢的效果.已有的常見免疫組化難題集錦1、石蠟切片和冰凍切片的比擬1要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片,這是今天我向一老師請教得出的結(jié)論.由于作石蠟切片時要高溫烤片,可能會破壞組織的抗原性,如果組織的抗原性較穩(wěn)定,那么可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的,可作冰凍切片.2冰凍切片的優(yōu)點是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性

19、,做免疫組化時不需抗原修復(fù)這一步.缺點是細胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細胞結(jié)構(gòu),可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚,做的片子沒石蠟的漂亮.當(dāng)你買一抗時,目錄上都寫著做什么樣的切片,如果它寫著只能做冰凍,就不能做石蠟,如寫著兩者都可,那就都能做.3石蠟切片的優(yōu)點可以保持組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),且容易存放在室溫,而冰凍切片比擬麻煩,一定要存在-80度的低溫冰箱中,尤其是用來做原位雜交的的切片,為了預(yù)防RNA降解,保存一貫很重要.由于石蠟切片可以切到4微米左右,所以原位雜交探針容易滲透到組織中去,容易成功,而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好.2、一抗的選擇要點和技巧是什么1單克隆和多克隆抗體的選擇.由一種克隆

20、產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體.單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié) 合,就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣.另一方面,即使是同一個抗原決定簇,在機體內(nèi)也可以由好幾種克隆來產(chǎn)生抗體,形成好幾種單克隆抗體混雜物,稱為多克隆抗體.在抗原抗體反應(yīng)中,一般單克隆抗體特異性強,但親和力相對小,檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗 體特異性稍弱,但抗體的親和力強, 靈敏度高,但易出現(xiàn)非特異性染色可以通過封閉等避免.2應(yīng)用范圍的選擇.有的一抗只能用于Western blotting ,或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至說明石蠟切片或冰凍切片.3種屬反響性的選擇speciesreactivity .這一點

21、很重要,說明這種抗體可能存在種屬差異,且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內(nèi)的抗原.4種屬來源,一般兔來源的多是多克??；而小鼠來源的多是單克隆, 但也有另外.根據(jù)此來源來選擇相應(yīng)的二抗.5生產(chǎn)廠家的選擇.如 santa Cruz公司抗體一般1ml,價格2100元左右；而 chemicon公司一抗一般 100ul ,價格2800元左右.這兩個 廠家的同一種抗體它的實際效價穩(wěn)定是不同的,我一般用后者抗體做免疫組化效果較好,而前者做Western blotting效果還可以.3、在什么情況下使用 TritonX-100 1 Triton X-100 化學(xué)名稱為聚乙二醇辛 基苯基醒,是一種去污劑.在免疫組

22、織化學(xué)10um厚切片和免疫細胞化學(xué)中一般用 Triton X-100作為細胞通透劑,在膜上打孔.2其作用原理：Triton X-100可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進入胞漿和胞核內(nèi),故在細胞免疫組化時尤為推薦使用,這樣抗體就能順利進入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合. 3Triton X-100 既是一種外表活性劑,也有抗氧化作用,具體參閱：&id=&sty=14、封閉血清的選擇原那么是什么1膜上或切片上有剩余的位點可以非特異性吸附抗體,造成后續(xù)結(jié)果的假陽性！2封閉血清一般是和二抗同一來源的,血清中動物自身的抗體,預(yù)先能和組織中有交叉反響的位點發(fā)生結(jié)合,

23、否那么在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合,會造成背景.3也可以用小牛血清、BSA羊血清等,但不能與一抗來源一致.5、抗體孵育條件的比擬1 一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度,其中4度效果最正確；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān),一般 37度1-2h,而4度過夜和從冰箱 拿出后37度復(fù)溫45min.2二抗一般室溫或 37度30min-1h ,具體時間需要摸索.6、一抗4度孵育后為什么要進行 37度復(fù)溫 1 一方面,預(yù)防切片從 4度直接 放入PBS易脫片；2另一方面,使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定.一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用,4度和37度時分子運動方式不同,前者分子碰撞機率和運動速度小于后者,

24、后者結(jié)合更快,但敏感性也提升了并易造成非特異染色.3其實,我更贊同后一種說法,因為我嘗試把肝臟或睪丸片子從4度過夜拿出后,直接用PBS洗沒發(fā)生過脫片現(xiàn)象. 事實勝于雄辯！7、DAB顯色時間如何把握1 DAB顯色時間不是固定的,主要由顯微鏡下限制顯色時間,到出現(xiàn)淺棕色本底時即可沖洗；2 DAB顯色時間很短如幾秒或幾十秒就出現(xiàn)很深的棕褐色,這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長,需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；3此外,假設(shè)很短時間就出現(xiàn)背景很深,還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全,需要延長封閉時間；4 DAB顯色時間很長如超過十幾分鐘才出現(xiàn)陽性染色,一方面可能說明你的抗體濃度過低

25、或孵育時間過短最好一抗4度過夜；另一方面就是封閉時間過長.8、免疫組化結(jié)果如何分析1陽性著色細胞計數(shù)法.在 40*光鏡下,隨機選擇不重疊的10個視野,人工或機器計數(shù)陽性著色細胞,每組36張不同動物組織切片,然后進行組間比擬即可.2灰密度分析法.通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同 區(qū)域、相同條件下用image j進行灰密度分析,然后進彳T統(tǒng)計分析即可.3評分法.通過在光學(xué)顯微鏡下對組織切片分別按染色程度03分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色、陽性范圍進行評分14分為025% 2650% 5175% 76100%,最終可以分數(shù)相 加,再進行比擬.對于以上這幾種方法,各有利弊,請細心選擇.

26、要想得到正確結(jié)果的前提 是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片.9、在什么情況下進行組織抗原修復(fù),抗原修復(fù)的條件是什么1由于組織中局部抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中,發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用,從而失去抗原性.通過抗原修復(fù),使得細胞內(nèi)抗原決定族重新暴露,提升抗原檢測率.2修復(fù)方法從強到弱一般分為三種,高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù).修復(fù)液也分為假設(shè)干種具體的 可以查閱相關(guān)資料,大量的：中性的、高 pH的等.3微波修復(fù),我們一般用6min*4次,效果不錯.10、內(nèi)源性過氧化物酶的滅活時間和濃度是什么1 一般3%過氧化氫滅活時間短點,可以10min左右；而過氧化氫那么可以適當(dāng)延長封閉時間,

27、一般 1030min.2用 西奈山環(huán)保組織固定液配置過氧化氫比雙蒸水或PBS能更好保護抗原和固定組織作用,過氧化氫孵育時間過長易引起脫片.3現(xiàn)用現(xiàn)配,配好后 4度避光保存.11、如何才能充分脫蠟1蠟不溶于水,如果脫蠟不干凈,少許蠟存留于切片上,將會引起染色不均勻、陽性物時隱時現(xiàn)、真假難辨、背景染色增加等.為了解決上述的 問題,切片在染色前必須徹底脫蠟,目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯,因它脫蠟力強,脫蠟時間較短；2脫蠟的時間要根據(jù)季節(jié),室溫和試劑的新鮮謀面是在不同.如果在夏天,室溫較高,脫蠟試劑也新鮮,那么脫蠟時間不需很多,3-5分鐘就已足夠.如果在冬天,室溫較低,脫蠟試劑也較陳舊,那么脫蠟時間

28、需要延長,10-20分鐘或更長.3當(dāng)天切的切片,燒烤2小時后進行染色,切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程,如果預(yù)先切好烤好的切片,在染色前,還必須對切片進行加溫 10-20分鐘,然后再行脫蠟,這樣脫蠟速度加快, 效果魁偉更好.總之,操作時應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié),不同的室溫,不同的試劑來決定,脫蠟的 時間,原那么上是要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟.12、如何最大限度地降低組織非特異性染色1縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來限制.這是最重要的一條.2 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色,建議試用單克隆抗體看看.3內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高含血 細胞多的組織,需要通過延長

29、滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；4非特異性組分與抗體結(jié)合,這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加 強封閉效果；5縮短DA那么育時間或降低 DABM度/過氧化氫濃度等；6適當(dāng)增加PBS沖洗次數(shù)和浸洗時間,在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；7預(yù)防標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片,這容易增強非特異性著色.13、蘇木素復(fù)染時間的把握1蘇木素復(fù)染時間要看當(dāng)時的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況,一般數(shù)秒 -數(shù)分鐘.不過這個如果染色不理想可以補救的.即：染 色深那么分化時間稍長些即可；染色淺那么再置于蘇木素中染色即可.2鹽酸酒精是分化,氨水是返蘭.作用不同.片子復(fù)染完后流

30、水振洗, 然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒 一定動作要快 后拿出流水振洗,在放入氨水中返蘭即可.3如果分化的顏色過淺,可以復(fù)置于蘇木素中染色.14、PBS的清洗方式選擇、次數(shù)和時間的選擇1單獨沖洗,預(yù)防交叉反響造成污染. 臨床上每天檢測的病例很多,所用的抗體種類及工程也多,如果在參加一抗孵育 完后,將它們在一個缸內(nèi)洗,這樣就會造成交叉污染,影響最后的結(jié)果.正確的做法是單獨 地進行沖洗,沖洗的 PBS為一次性,保證切片沒有相互交叉污染的時機.2溫柔沖洗,預(yù)防切片的脫落.沖洗切片,取出切片,將PBS從上輕輕地沖洗,讓 PBS自上而下流下來,不要拿起切片將PBS對準切片沖洗,這樣由于沖出的 PBS有一定的沖擊

31、力,很容易使切片周 邊引起松動,導(dǎo)致切片的脫落.3沖洗的時間要足夠,才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì).沖洗切片有人提出用微振蕩器振染,振下未結(jié)合的各種物, 使之不產(chǎn)生背景,此種做法一是浪費時間,二是很容易導(dǎo)致切片的脫落.切片的沖洗據(jù)實踐認為,用一小燒杯柔和地于切片上沖 洗,就能徹底沖洗去未結(jié)合的物質(zhì),無需附加其它條件,沖洗好于切片上再注入PBS持續(xù)2分鐘左右就完全足夠了. 4 PBS的PH和離子強度的使用和要求.劉彥仿指出：中性及 弱磴性條件PH7- 8有利于免疫復(fù)合物的形成,而酸性條件那么有利于分解；低離子強度有利于免疫復(fù)合物的形成,而高離子強度那么有利于分解.免疫組化PBSa們目前常用的 PBS的P

32、H在濃度是,根據(jù)本室十幾年來的使用情況,認為該溶液價格廉價配制方面,使用效果 好.5常用試劑的配制和使用.在免疫組織化學(xué)的染色過程中,用得最多的試劑就是緩 沖液,由于切片在整個染色中,抗體的加、換、切片的沖洗,DAB的配制都離不開緩沖液.可見緩沖液在整個染色中都起至關(guān)鍵的作用,緩沖液的過酸或偏堿,都將影響染色的結(jié)果.15、脫片產(chǎn)生的原因和如何預(yù)防脫片1多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題.我原先是買的,邁新按說也是不錯的, 可是都脫成什么樣子了. 后面補做第二批時用的病理科老師 自己做的片子,要好一點.2組織切的不好,切片機的問題例如比擬老的舊的機器切的 厚或者不均勻,或者切片者手法不好等.3組織的問題,我用的組織癌癥的很多,越是癌癥組織有壞死之類越容易脫.4沒烤好,時間短溫度不夠之類.5操作的時候甩的太猛了,有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩,用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水.