最新課件單克隆抗體

1、McAb and PcAb雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù)的誕生的誕生 1975年年8月月7日日，Kohler和和Milstein在英國自然在英國自然雜志上發(fā)表了題為雜志上發(fā)表了題為“分泌具有預定特異性抗體的分泌具有預定特異性抗體的融合細胞的持續(xù)培養(yǎng)融合細胞的持續(xù)培養(yǎng)”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity） 1984年度榮獲諾貝爾生理學和醫(yī)學獎年度榮獲諾貝爾生理學和醫(yī)學獎 一、一、 雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)的基本原理 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）：）：細胞融合劑，使免疫的

2、小鼠脾細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細細 胞與小鼠骨髓瘤細胞融合胞與小鼠骨髓瘤細胞融合 HATHAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復的免疫學檢測篩選克反復的免疫學檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤隆化增殖的雜交瘤 細胞系細胞系 單克隆抗體生成：單克隆抗體生成：接種雜交瘤接種雜交瘤 細胞于小鼠腹腔，腹細胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體水中即可得到高效價的單克隆抗體抗體種類：抗體種類：第一代抗體第一代抗體 多克隆抗體多克隆抗體 （polyclonal antibody)第二代抗體第二代抗體 單克隆抗體單克隆抗體 （monoclonal antibody)第三代抗體第三代抗體 基因工程抗體

3、基因工程抗體 （genetic engineering antibody)B B淋巴細胞淋巴細胞: :壽命短壽命短, ,分泌特分泌特異系性抗體異系性抗體骨髓瘤細胞：骨髓瘤細胞：壽命長壽命長雜交瘤細胞：雜交瘤細胞：壽命長，單壽命長，單 隆抗體隆抗體流流程程 不產(chǎn)生不產(chǎn)生IgIg的重鏈和輕鏈的重鏈和輕鏈 HGPRT-;TK- 與提供淋巴細胞的動物品系相同與提供淋巴細胞的動物品系相同（一）小鼠骨髓瘤細胞（一）小鼠骨髓瘤細胞小鼠骨髓瘤細胞系均來源小鼠骨髓瘤細胞系均來源于于BALB/c小鼠小鼠，大鼠骨髓瘤細，大鼠骨髓瘤細胞都來源于胞都來源于LOU/c大鼠大鼠建立的骨髓瘤細胞系建立的骨髓瘤細胞系 : SP

4、2/0-Ag14， X63-Ag8.653 NSO/1 動動 物：物：BALB/BALB/c c小鼠小鼠4 48 8周齡周齡20g20g25g25g體重體重（二）免疫脾細胞（二）免疫脾細胞細胞性抗原：細胞性抗原：（1 12 2）10107 7/ /只，不加佐劑，只，不加佐劑，2 23 3周重復一次周重復一次可溶性抗原：可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑首次，完全福氏佐劑+100+100微克抗原，微克抗原，3 36 6周周100100200200微克抗原，融合前微克抗原，融合前3 3天，加強免疫天，加強免疫體內(nèi)免疫法體內(nèi)免疫法-免疫原性強、來源充分的抗原，對于免疫原性強、來源充分的抗原，對于免疫原性

5、很弱或?qū)C體有害（如引起免疫抑制）的免疫原性很弱或?qū)C體有害（如引起免疫抑制）的抗原就不適用了抗原就不適用了免疫小鼠免疫小鼠。淋巴細胞淋巴細胞。漿細胞漿細胞?？乖臃N抗原接種免疫原特性免疫原特性抗原量抗原量接種次數(shù)接種次數(shù)間隔時間隔時間間單抗的特性單抗的特性抗體滴度抗體滴度親和性親和性免疫原性強免疫原性強（如細胞、細（如細胞、細菌和病毒等）菌和病毒等）10106 6-10-107 7個細胞個細胞或或1-10ug1-10ug2-42-42-42-4周周高高中等至強中等至強免疫原性中等免疫原性中等10-100ug10-100ug2-42-42-42-4周周中等或高中等或高中等或強中等或強免疫原性弱

6、免疫原性弱A.20-400ugA.20-400ug2-42-4隨后隨后2-32-3每月每月2-32-3月月中等中等強強B.10-50ugB.10-50ug其后其后200-400ug200-400ug2 2其后其后4 4每月每月每天每天中等中等中等中等C.10-100ugC.10-100ug2 2其后其后4 4其后其后“休息休息”最后加強最后加強每月每月1010天天1-21-2月月中等中等中等或強中等或強表表6-1 不同免疫抗原的免疫程序不同免疫抗原的免疫程序（引自劉秀梵，（引自劉秀梵，1994）培養(yǎng)液：培養(yǎng)液：RPM1640培養(yǎng)液培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)液（三）細胞融合（三）細胞融合細胞融合劑

7、：細胞融合劑：PEG:分子量分子量4000 的的PEG是最常用的細胞融合劑是最常用的細胞融合劑作用機理：作用機理：誘導細胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細胞誘導細胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合膜易打開而有助于細胞融合作用特點：作用特點：隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEGPEG，其純度與毒性有所不同，其純度與毒性有所不同最早仙臺病毒被用做融合劑，后來發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（最早仙臺病毒被用做融合劑，后來發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）的融合效果更）的融合效果更好，且避免了病毒的污染問題好，且避免了病毒的污染問題培養(yǎng)骨髓瘤細胞：培養(yǎng)骨髓瘤細胞：選擇對數(shù)生長

8、期的細胞進行傳代培養(yǎng)選擇對數(shù)生長期的細胞進行傳代培養(yǎng)細胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊細胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細胞返祖：定期用避免細胞返祖：定期用8-AG8-AG處理細胞處理細胞注意事項：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細胞分裝凍存注意事項：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細胞分裝凍存于于-80-80或液氮及干冰中或液氮及干冰中取已經(jīng)免疫的取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。同時通過頸脫位致死小鼠，浸泡于同時通過頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中酒精中5分鐘分鐘通常每只小鼠通常每只小鼠11

9、08-2.5108個脾細胞，每只大鼠脾個脾細胞，每只大鼠脾臟可得臟可得5108-10108脾細胞。脾細胞。免疫脾細胞的制備：免疫脾細胞的制備：1 110108 8的的淋巴細胞淋巴細胞 無菌手術(shù)無菌手術(shù)常用的飼養(yǎng)細胞有胸腺細胞、正常脾細胞和腹腔巨常用的飼養(yǎng)細胞有胸腺細胞、正常脾細胞和腹腔巨噬細胞噬細胞其中其中MQMQ還有清除死亡細胞的作用還有清除死亡細胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過飼養(yǎng)存活一般不超過2 2周，不影響雜交瘤細胞的純化周，不影響雜交瘤細胞的純化 在細胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤在細胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數(shù)分散的雜交瘤細胞和脾

10、細胞相繼死亡，此時單個或少數(shù)分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這種被加入的活細胞稱為這種被加入的活細胞稱為飼養(yǎng)細胞（飼養(yǎng)細胞（Feeder cells）。）。飼養(yǎng)細胞：飼養(yǎng)細胞：。飼養(yǎng)細胞飼養(yǎng)細胞融合方法融合方法a、將、將1108脾細胞與脾細胞與2107-5107骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14混合于一支混合于一支50ml融合管融合管中，補加不完全培養(yǎng)基至中，補加不完全培養(yǎng)基至30ml，充分混勻。，充分混勻。b、1000r/min離心離心5-10分鐘，將上清盡量吸凈。分鐘，將上清盡量吸凈。c、在手掌上輕擊融合

11、管底，使沉淀細胞松散均勻、在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細胞松散均勻;置置40水浴中預熱。水浴中預熱。d、用、用1ml吸管在吸管在1分鐘左右（最佳時間為分鐘左右（最佳時間為45秒）加預熱至秒）加預熱至40的的50% PEG（PH 8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。，邊加邊輕輕攪拌。e、用、用10ml吸管在吸管在90秒內(nèi)加秒內(nèi)加20-30ml預熱至預熱至37的不完全培養(yǎng)基；的不完全培養(yǎng)基；20-37靜置靜置10分分鐘。鐘。f、1000r/min 5分鐘；棄去上清。分鐘；棄去上清。g、加入、加入5ml HAT培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細胞，使其懸浮并混勻，然后補加含腹腔培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細胞，使其懸浮并混

12、勻，然后補加含腹腔巨噬細胞的巨噬細胞的HAT培養(yǎng)基至培養(yǎng)基至80-100ml。h、分裝、分裝96孔細胞培養(yǎng)板，每孔孔細胞培養(yǎng)板，每孔0.10-0.15ml；分裝；分裝24孔板，每孔孔板，每孔1.0-1.5ml；然后將；然后將培養(yǎng)板置培養(yǎng)板置37，6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。i、5天后用天后用HAT培養(yǎng)基換出培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。j、7-10天后用天后用HT培養(yǎng)基換出培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；（第培養(yǎng)基；（第14天后可用普通完全培養(yǎng)基）。天后可用普通完全培養(yǎng)基）。l、經(jīng)常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積、經(jīng)常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上

13、清供抗體以上時吸出上清供抗體檢測。檢測。10102020天出現(xiàn)克隆天出現(xiàn)克隆HATHAT篩選篩選雜交瘤細胞在融合后雜交瘤細胞在融合后2周左右即可篩選，周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測。來，通常也稱為抗體檢測。融合細胞的早期培養(yǎng)融合細胞的早期培養(yǎng)常用的抗體檢測方法：常用的抗體檢測方法：（1）免疫酶技術(shù)）免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應的特異性和酶對底物顯色反應的高效催免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應的特異性和酶對底物顯色反應的高效催化作用有機結(jié)合而成的免疫學技術(shù)。由于它特異性高，靈敏度高，現(xiàn)已化作用有機結(jié)合而

14、成的免疫學技術(shù)。由于它特異性高，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于篩選和鑒定單抗。廣泛用于篩選和鑒定單抗。用可溶性抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗（用可溶性抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）用全菌抗原的用全菌抗原的ELISA用全細胞抗原的用全細胞抗原的ELISA抗體捕捉抗體捕捉ELISA試驗試驗ABC-ELISA試驗試驗Dot-ELISA試驗試驗免疫組化染色法免疫組化染色法（2）免疫熒光技術(shù)）免疫熒光技術(shù)間接免疫熒光法間接免疫熒光法活細胞的膜熒光染色活細胞的膜熒光染色（3）間接血凝試驗）間接血凝試驗（4）放射免疫測定）放射免疫測定HGPRTHGPRT酶與酶與TKTK酶酶：次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化

15、酶胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)（四）雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)應用液：應用液：8-8-氮氮雜雜鳥嘌呤鳥嘌呤 聚乙二醇聚乙二醇HATHAT培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤次黃嘌呤A（Aminopterin）：）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷斷DNA合成主要途徑合成主要途徑 T(Thymidine)：胸胸腺嘧啶核苷；腺嘧啶核苷；“核苷酸前體核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成供細胞通過替代途徑合成DNADNAHATHAT選擇作用：選擇作用：淋巴細胞：淋巴細胞：不能生長，不能生長，5 57 7天死亡；天死亡；DNADNA合成的

16、合成的主要途徑被主要途徑被A A阻斷阻斷骨髓瘤細胞：骨髓瘤細胞：不能生長，不能生長，5 57 7天死亡；天死亡；HGPRTHGPRT缺缺乏，乏，DNADNA合成的替代途徑受阻合成的替代途徑受阻SP2/O: HGPRT- ，TK-;長長命命脾細胞脾細胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命短命(7天天)雜交雜交瘤細胞瘤細胞:HGPRT+ ，TK+; 長長命命骨髓瘤細胞、脾細胞與骨髓瘤細胞、脾細胞與雜交雜交瘤細胞瘤細胞雜交瘤細胞：雜交瘤細胞：長期生長繁殖長期生長繁殖利用淋巴細胞的利用淋巴細胞的HGPRT，將，將H合成為嘌呤合成為嘌呤堿并最終與堿并最終與T一起合成一起合成DNA從淋巴細胞獲得產(chǎn)生某種抗體

17、的遺傳信息從淋巴細胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力有限稀釋法有限稀釋法(limiting dilution) FACS法法（fluorescence activated cell sorter）軟瓊脂平板法軟瓊脂平板法(soft agar method) 二、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)與凍存二、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)與凍存特點：特點：不需任何特殊設備不需任何特殊設備克隆出現(xiàn)效率高克隆出現(xiàn)效率高實驗室常用方法實驗室常用方法方法：方法：細胞懸液通過系列稀釋細胞懸液通過系列稀釋每個培養(yǎng)孔含每個培養(yǎng)孔含0.50.51 1個細胞個細胞有限稀釋法

18、有限稀釋法每種雜交瘤細胞分裝每種雜交瘤細胞分裝96孔板一塊，每個稀釋度孔板一塊，每個稀釋度32孔，每孔量為孔，每孔量為0.2ml，每孔的雜交瘤細胞數(shù)分別為，每孔的雜交瘤細胞數(shù)分別為0.5、3和和10。效率最高效率最高價格昂貴價格昂貴FACS軟瓊脂平板法軟瓊脂平板法(soft agar method)37、7.5%濕潤培養(yǎng)濕潤培養(yǎng)7-14天；克隆生長至天；克隆生長至2mm時，用毛細時，用毛細吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細胞的吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細胞的24孔板，擴大孔板，擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)。吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴大培養(yǎng)吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴大

19、培養(yǎng)、凍存。、凍存。配制方案：配制方案：雜交瘤細胞（雜交瘤細胞（1 15 5）x10 x106 6/ml) + /ml) + 細胞凍存液細胞凍存液(30%(30%40% 40% 牛血清，牛血清，50%50%60% RPMI-164060% RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)液，10%DMSO )10%DMSO )“慢凍慢凍”：分步冷凍，分步冷凍，30-7030-70液氮液氮 保存數(shù)年至數(shù)十年保存數(shù)年至數(shù)十年“快融快融”：取出立即浸入取出立即浸入37374040水浴中，使其迅速融化、水浴中，使其迅速融化、復蘇復蘇雜交瘤細胞的凍存與復蘇雜交瘤細胞的凍存與復蘇在建立雜交瘤細胞的過程中，有時一次融合產(chǎn)生很

20、多在建立雜交瘤細胞的過程中，有時一次融合產(chǎn)生很多“陽性陽性”孔，孔，來不及對所有的雜交瘤細胞作進一步的工作，需要把其中一部分來不及對所有的雜交瘤細胞作進一步的工作，需要把其中一部分細胞凍存起來；另一方面，為了防止實驗室可能發(fā)生的意外事故細胞凍存起來；另一方面，為了防止實驗室可能發(fā)生的意外事故防止污染防止污染避免染色體丟失避免染色體丟失防止非分泌細胞的過度生長防止非分泌細胞的過度生長防止細胞密度過高而死亡防止細胞密度過高而死亡細胞冷凍的意義細胞冷凍的意義（1）單克隆性的確定）單克隆性的確定包括雜交瘤細胞的染色體分析、單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定和包括雜交瘤細胞的染色體分析、單抗免疫球蛋白重

21、鏈和輕鏈類型的鑒定和單抗純度鑒定等。單抗純度鑒定等。A A、雜交瘤細胞的染色體分析、雜交瘤細胞的染色體分析 對雜交瘤細胞進行染色體分析可獲得其是否是真正的雜交瘤細胞的客對雜交瘤細胞進行染色體分析可獲得其是否是真正的雜交瘤細胞的客觀指標之一，雜交瘤細胞的染色體數(shù)目應接近兩種親本細胞染色體數(shù)目的總觀指標之一，雜交瘤細胞的染色體數(shù)目應接近兩種親本細胞染色體數(shù)目的總和，正常小鼠脾細胞的染色體數(shù)目為和，正常小鼠脾細胞的染色體數(shù)目為40，小鼠骨髓瘤細胞，小鼠骨髓瘤細胞SP2/0為為62-68，NS-1為為54-56； B 、單抗免疫球蛋白的類別和亞類鑒定單抗免疫球蛋白的類別和亞類鑒定 免疫擴散免疫擴散 E

22、LISA C、單抗純度的鑒定、單抗純度的鑒定 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、）、SDS-PAGE、等電點聚焦電泳（、等電點聚焦電泳（IEF）及免疫及免疫 轉(zhuǎn)印分析（轉(zhuǎn)印分析（WB）等方法都可用于鑒定單抗的純度。）等方法都可用于鑒定單抗的純度。PAGE、SDS-PAGE、IEF、WB（三三）單克隆抗體的性質(zhì)鑒定單克隆抗體的性質(zhì)鑒定（2）單抗理化特性的鑒定）單抗理化特性的鑒定抗體親合力是指抗體與抗原或半抗原結(jié)合的程度，其高低主要是由抗體親合力是指抗體與抗原或半抗原結(jié)合的程度，其高低主要是由抗體和抗原分子的大小、抗體分子結(jié)合簇（部）和抗原決定簇之間抗體和抗原分子的大小、抗體分子

23、結(jié)合簇（部）和抗原決定簇之間的立體構(gòu)型的合適程度決定的。親合力通常以平均內(nèi)在結(jié)合常數(shù)（的立體構(gòu)型的合適程度決定的。親合力通常以平均內(nèi)在結(jié)合常數(shù)（K）表示。）表示。常用的方法有競爭常用的方法有競爭ELISA、非競爭性、非競爭性ELISA、間接、間接ELISA、間接法夾心間接法夾心ELISA等等（3）單抗與相應抗原的反應性測定）單抗與相應抗原的反應性測定包括各類免疫血清學試驗、生物學試驗和免疫化學技術(shù)等包括各類免疫血清學試驗、生物學試驗和免疫化學技術(shù)等 三、單克隆抗體的制備三、單克隆抗體的制備 經(jīng)過反復克隆化獲得的經(jīng)過反復克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株抗體陽性雜交瘤細胞株應立即擴應立即擴大培養(yǎng)（

24、除及時凍存的細胞外）。因多次傳代易引起染色體大培養(yǎng)（除及時凍存的細胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應盡逐漸丟失而使細胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制備單克隆抗體。早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制備單克隆抗體。 （一）單克隆抗體的產(chǎn)生（一）單克隆抗體的產(chǎn)生1 1 動物體內(nèi)誘生方法：動物體內(nèi)誘生方法：每次用每次用BALB/cBALB/c或或F1F1代小鼠，（代小鼠，（5 51010）10105 5/ /只只, , 使用的動物當然首選使用的動物當然首選BALB/c小鼠小鼠 ,將雜交瘤細胞將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔

25、內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長雜交瘤，接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體并產(chǎn)生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高。可見該法操作簡便、經(jīng)濟，不過，腹?jié)舛群芨??？梢娫摲ú僮骱啽?、?jīng)濟，不過，腹水中?；煊行∈蟮母鞣N雜蛋白（包括水中?；煊行∈蟮母鞣N雜蛋白（包括Ig）腹腔注射法腹腔注射法2 2 體外培養(yǎng)法：體外培養(yǎng)法：a、懸浮培養(yǎng)法：、懸浮培養(yǎng)法：小規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，通過攪拌小規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，通過攪拌使細胞呈懸浮狀態(tài)；而大規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用發(fā)酵式的生物使細胞呈懸浮狀態(tài)；而大規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用發(fā)酵式的生物反應器反應器b、微載體培養(yǎng)法、

26、微載體培養(yǎng)法Microcarrier：主要以交聯(lián)瓊脂糖或葡聚糖、主要以交聯(lián)瓊脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作為基質(zhì)的產(chǎn)品聚苯乙烯、玻璃等作為基質(zhì)的產(chǎn)品c、中空纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)：、中空纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)：由中空纖維生物反應器、培養(yǎng)基由中空纖維生物反應器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動泵等組成容器、供氧器和蠕動泵等組成d、微囊化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)：、微囊化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)：先將雜交瘤細胞微囊化，然后將此先將雜交瘤細胞微囊化，然后將此具有半透膜的微囊置于培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)，一定時間后，具有半透膜的微囊置于培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)，一定時間后，從培養(yǎng)液中分離出微囊，沖洗后打開囊膜，離心后即可獲得從培養(yǎng)液中分離出微囊，沖洗

27、后打開囊膜，離心后即可獲得高濃度的單抗。高濃度的單抗。（3）雜交瘤細胞的無血清培養(yǎng)）雜交瘤細胞的無血清培養(yǎng)已報道的各類無血清培養(yǎng)基有含有大豆類脂的、含有酪已報道的各類無血清培養(yǎng)基有含有大豆類脂的、含有酪蛋白的、化學限定性的、無蛋白的、含有血清低分子量蛋白的、化學限定性的、無蛋白的、含有血清低分子量成分的無血清培養(yǎng)基成分的無血清培養(yǎng)基利于單抗的純化，有助于大規(guī)模生產(chǎn)，可減少細胞污染利于單抗的純化，有助于大規(guī)模生產(chǎn)，可減少細胞污染的機會，且成本較低。的機會，且成本較低。但無血清培養(yǎng)細胞的生產(chǎn)率低、細胞密度小，影響了單但無血清培養(yǎng)細胞的生產(chǎn)率低、細胞密度小，影響了單抗的產(chǎn)量；抗的產(chǎn)量；可溶性抗原：可

28、溶性抗原：ELISAELISA抗體捕獲法抗體捕獲法細胞、亞細胞結(jié)構(gòu)上的抗原：細胞、亞細胞結(jié)構(gòu)上的抗原：免疫熒光法免疫熒光法（用丙酮和甲醇按（用丙酮和甲醇按1:11:1比例固定細胞）比例固定細胞）（二）單克隆抗體的純化（二）單克隆抗體的純化前前5 5天進行天進行, ,預先腹腔注射預先腹腔注射pristanepristane（1 15 5）10106 6細胞細胞1 13 3w w形成腹水形成腹水腹水型單抗的純化腹水型單抗的純化高滴度腹水高滴度腹水鹽析沉淀鹽析沉淀親和層析親和層析離子交換層析離子交換層析 McAb McAb的純化的純化 ELISAELISA多頭加樣槍多頭加樣槍ELISAELISA。免

29、疫熒光法免疫熒光法（四）單克隆抗體的特性（四）單克隆抗體的特性高度特異性高度特異性高度的均一性和可重復性高度的均一性和可重復性 弱凝集反應和不呈現(xiàn)沉淀反應弱凝集反應和不呈現(xiàn)沉淀反應對環(huán)境敏感性對環(huán)境敏感性優(yōu)點優(yōu)點 ：在體外在體外“永久永久”地存活并傳代地存活并傳代用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標記抗體為特點的免疫學分析方法體。適用于以標記抗體為特點的免疫學分析方法可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導向治療可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導向治療（五）單克隆抗體的優(yōu)點與局限性（五）單克隆抗體的優(yōu)點與局限性局限性局限性 ：固有的親

30、和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍反應強度不如多克隆抗體反應強度不如多克隆抗體制備技術(shù)復雜、費時費工、價格較高制備技術(shù)復雜、費時費工、價格較高 McAb McAb PcPcAbAb 抗原要求抗原要求 可以不純可以不純 純度高純度高得量得量 高高 低低特異性特異性 高高 低低 穩(wěn)定穩(wěn)定 低低 高高 沉淀反應沉淀反應 無無 有有成本成本 高高 低低McAbMcAb與與PcPcAbAb的比較的比較三、基因工程抗體制備三、基因工程抗體制備基因工程抗體基因工程抗體(Genetic engineering antibody) 根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程

31、方法，在根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或修飾后導入受體細胞進行表達，產(chǎn)生新型抗體。修飾后導入受體細胞進行表達，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體。價抗體和雙特異性抗體。 將小鼠將小鼠IgIg基因敲除，轉(zhuǎn)染人基因敲除，轉(zhuǎn)染人IgIg基因，在基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人AbAb，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體大量完全人源化抗體（一）人源化抗體（一）人源化抗體方法：方法： 從雜交瘤細胞分離出

32、功能性可變區(qū)基因，與人從雜交瘤細胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人IgIg恒定恒定區(qū)基因連接，插入適當表達載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，表達人區(qū)基因連接，插入適當表達載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，表達人- -鼠嵌合抗體鼠嵌合抗體特點：特點： 減少了鼠源性抗體的免疫原性減少了鼠源性抗體的免疫原性 保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力1 1、嵌合抗體、嵌合抗體嵌合抗體嵌合抗體定義：定義：指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V V）中互補）中互補決定簇（決定簇（CDRCDR）序列改換成鼠源單抗）序列改換成鼠源單抗CDRCDR序列。重構(gòu)成既具序列。重構(gòu)成既具

33、有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。RAbRAb亦叫亦叫“重構(gòu)型抗體重構(gòu)型抗體”，因其主要涉及，因其主要涉及CDRCDR的的“移植移植”，又可稱為又可稱為“CDRCDR移植抗體移植抗體意義：意義：多種特異的鼠源單抗有可能應用于臨床治療多種特異的鼠源單抗有可能應用于臨床治療2 2、改型抗體、改型抗體FabFab：抗原結(jié)合片斷抗原結(jié)合片斷FvFv：可變區(qū)片段可變區(qū)片段ScFvScFv：單鏈可變區(qū)片段單鏈可變區(qū)片段SdAbSdAb：單區(qū)抗體單區(qū)抗體 （二）小分子抗體（二）小分子抗體小分子抗體小分子抗體其它生物活性蛋白融合其它生物活性蛋白

34、融合（三）抗體融合蛋白（三）抗體融合蛋白 許多抗原抗體反應要求雙價的抗原結(jié)合位點，使抗原許多抗原抗體反應要求雙價的抗原結(jié)合位點，使抗原分子上的兩個表位交聯(lián)或使兩個抗原分子連接。將識別腫分子上的兩個表位交聯(lián)或使兩個抗原分子連接。將識別腫瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應細胞表面分子的抗瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應細胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應細胞更容易與腫瘤細胞結(jié)合識別，體連結(jié)在一起，可使效應細胞更容易與腫瘤細胞結(jié)合識別，取得殺傷腫瘤細胞的作用。取得殺傷腫瘤細胞的作用。（四）雙特異性抗體（四）雙特異性抗體 分別分離純化兩種不同的分別分離純化兩種不同的McAbMcAb，使各抗體解離為單價，使各抗體解離為單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體通過化