綜合實驗化能異養(yǎng)微生物的分離與純化(實驗要求)

1、* *化能異養(yǎng)微生物的分離與純化（綜合）安排說明：本實驗要求以實驗小組為單位完成。第8周起，各小組應(yīng)該下載相關(guān)資料，做好預(yù)習（器材申報與領(lǐng)用）。集中實驗時間：11周13周。11周：提交實驗材料要求清單一式兩份，一份上交，弁根據(jù)清單領(lǐng)取器材。12周：開展實驗，實驗完成后整理實驗結(jié)果，撰寫實驗報告。13周：完成整個實驗器材歸還。本次實驗考評占實驗總成績的 20%!考評內(nèi)容包括實驗紀律、操作技術(shù)、實驗報告。實驗結(jié)果組內(nèi)共用，實驗報告自己寫。注意：期末實驗課成績 =實驗考試（卷面成績、操作各占50%） 50%+實驗報告20%+綜合、 設(shè)計實驗成績20%+平時成績10%）第一部分：實驗原理及目的要求目的

2、要求1 ?掌握細菌、放線菌、酯母菌和霉菌稀釋分離、劃線分離等技術(shù)。2 ?學習從樣品中分離、純化出所需菌株。3 ?學習弁掌握平板傾注法和斜面接種技術(shù)，了解培養(yǎng)細菌、放線菌、酯母菌及霉菌四大類微生物的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間。4 ?學習平板菌落計數(shù)法。基本原理不同土壤是微生物生活的大本營， 是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的微生物的主要菌源。土樣中各類微生物數(shù)量不同，一般土壤中細菌數(shù)量最多，其次為放線菌和霉菌。一般在較干燥，偏堿性、有機質(zhì)豐富的土壤中放線菌數(shù)量較多；酯母菌在一般土壤中的數(shù)量較少，而在水果表皮、葡萄園、果園土中數(shù)量多些。本次實驗從土壤中分離細菌、放線菌和霉菌；白面曲（發(fā)面用的引子）或酒曲或果園土

3、中分離酯母菌。1）為了分離和確保獲得某種微生物的單菌落，首先要考慮制備不同稀釋度的菌懸液。各類菌的稀釋度因菌源、采集樣品時的季節(jié)、氣溫等條件而異。2）其次，應(yīng)考慮各類微生物的不同特性，避免樣品中各類微生物的相互干擾，通常需要使用不同的培養(yǎng)基，進行富集和選擇培養(yǎng)。如細菌或放線菌在中性或微堿性環(huán)境較多？但細菌比放線菌生長快，分離放線菌時，一般在制備土壤稀釋液時添加10頡或在分離培養(yǎng)基中加相應(yīng)的抗生素以抑制細菌和霉菌（如加鏈霉素25-50/mL以抑制細菌；添加制霉菌素50/ mL或多菌靈30呃/ mL以抑制霉菌）;酯母菌和霉菌都喜酸性環(huán)境，一般酯母菌只能以糖為碳源，不能直接利用淀粉，酯母菌在pH 5

4、時生長極快。細菌生長適宜的酸堿度為 pH7,所以分離酯母菌時只要選擇好適宜的培養(yǎng)基和pH,可降低細菌增殖率，霉菌生長慢，也不干擾酯母菌分離。若分離霉菌，需降低細菌增殖率，一般培養(yǎng)基臨用前須添加滅過菌的乳酸或鏈霉素。為了防止菌絲蔓延干擾菌落計數(shù)，分離霉菌時常在培養(yǎng)基中加入化學抑制劑。3）要想獲得某種微生物的純培養(yǎng)，還需提供有利于該微生物生長繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。四大類微生物的分離培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間見表表1四大類微生物的分離條件樣品來源分離對象稀釋度培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)溫度-C)培亦時間/d土樣細菌10-5 , 10 6、7,10牛肉膏蛋白豚303612土樣放線菌710-3 , 10-4

5、,10-5高氏1號2857土樣霉菌10-2 , 10-3 ,104馬丁氏培養(yǎng)基283035面曲或土樣酵母菌10-4 , 10-5 ,10-5豆芽汁培養(yǎng)基283023細菌分離平板細菌單菌落牛肉膏蛋白豚303712注：本實驗的目標在于兩項核心實驗操作技能（按美國微生物學會核心課程實驗操作技能第3條）：1）無菌操作技術(shù)一一包括滅菌技術(shù)及保持相關(guān)器具的無菌狀態(tài)；無菌操作技術(shù)；獲得微生物樣本；2）梯度稀釋技術(shù)估算微生物的數(shù)目一一正確選擇和使用移液管和移液裝置；正確涂布樣本以準確計數(shù)；估計所需要稀釋的倍數(shù)；根據(jù)平板計數(shù)值推測出起始樣本的CFU或PFU第二部分：綜合性實驗一一化能異養(yǎng)微生物的分離純化（自主實

6、驗設(shè)計與要求）一、分離四大類微生物（細菌、放線菌、酯母、霉菌） ，要求每類型微生物各分離到2株菌，純化后以斜面（8支）的形式交驗；計算所采集土壤中的細菌含量（CFU要求交驗計數(shù)所 用的12塊平板）。二、技術(shù)達標1. 培養(yǎng)基的配制：根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要特點，配制相應(yīng)的培養(yǎng)基，弁進行培養(yǎng)基的驗證。2?掌握梯度稀釋法、劃線法基本技術(shù)，其中劃線法要求每人獨立完成一份。3 .對所分離的菌株其菌落特征的表述（列表） 。4 .小組的管理與合作。三、實驗結(jié)果與匯報1.綜合報告：全組撰寫一份綜合報告。含預(yù)方案（主要是器材計劃、時間安排），執(zhí)行記錄，結(jié)論以及綜合分析?？砂葱枰孕性O(shè)計表格，規(guī)范執(zhí)行、規(guī)范記錄。

7、報告的寫作，請嚴格按照我院報告的格式要求，弁參考網(wǎng)絡(luò)課程中“實驗報告互評的評分要求”中的相關(guān)要求執(zhí)行。2.個人實驗報告：每人一份實驗報告，重點報告實驗現(xiàn)象、觀察思考，結(jié)果分析，綜合體會等，不涉及方案及實驗原理、步驟等的記錄。3實驗匯報，以實驗小組為單位，制作PPT,交流。小組互評，推優(yōu)。四、實驗安排與完成時間1 .本周完成方案學習與器材申請，弁填寫附表 1、2相關(guān)內(nèi)容。（見附錄）本周、下周為集中實驗時間，在實驗課所安排的時間，由實驗老師集中指導(dǎo)。各組也可自行安排實驗時間，在實驗小班科代表的統(tǒng)一安排下，聯(lián)系實驗室開展實驗。2 .完成時間：十五周前。本次練習中建議同學們利用實驗室提供的材料，自己練

8、習棉塞的制作。第三部分 實驗內(nèi)容（技術(shù)要求參考資料）提示：本次實驗所提供的方案僅供參考。各組在達到目的的情況下，可以自行設(shè)計自己的方案，但本方案中所提到的實驗操作細節(jié)，對實驗質(zhì)量的把握很有幫助，值得關(guān)注。材料與用品1 .菌源 選定采土地點后， 鏟去表土層2? 3cm，取3? 10cm深層土壤10g，裝入已滅過菌 的牛皮紙袋內(nèi).封好袋口，弁記錄取樣地點、環(huán)境及日期。土樣采集后應(yīng)及時分離，凡不能立即分離的樣品，應(yīng)保存在低溫、干燥條件下，盡量減少其中菌種的變化。從 面曲中分離酯母菌，也可用酒曲等替代。2 ?培養(yǎng)基肉膏蛋白陳培養(yǎng)基（）、馬丁氏培養(yǎng)基、高氏合成一號培養(yǎng)基、豆芬汁葡萄糖培養(yǎng)基（注意：需要制

9、平板和斜面，劃線法所用固體培養(yǎng)基，建議瓊脂濃度為22.5%,使平 板具有一定的硬度，便于劃線操作 ）3 .無菌水或無菌生理鹽水配制生理鹽水.分裝于250mL錐形瓶中，每瓶裝 99mL （或95mL分離霉菌用）,每瓶內(nèi)裝10粒玻璃珠；分裝試管，每管裝約4.55mL （不超過試管高度的1/5 ） o4 .其他試劑與用品無菌培養(yǎng)皿、無菌移液管、無菌涂棒（刮刀卜稱量紙、藥匙、洗耳球、10姍溶液各組根據(jù)實驗要求，統(tǒng)計后以表格形式申報所需要材料（參考表2）1微生物的分離及純化培養(yǎng)微生物的分離與純化常用技術(shù)主要包括稀釋分離法、劃線分離法。稀釋分離法將樣液進行梯度稀釋后，結(jié)合所需要分離的菌種特點，選擇一定稀釋

10、度的樣液進行接種培養(yǎng)，或涂布法或混菌法，對已經(jīng)稀釋的樣液中的菌體進行培養(yǎng)，獲得菌落純的細胞。劃線法可以直接獲得單菌落。*稀釋分離法通過稀釋，結(jié)合平板分離的純化菌株的方法有傾注法和涂布法兩種。本次實驗分離細菌、放線菌、霉菌時采用傾注法，酯母菌分離采用涂布法。以下以細菌及放線菌的分離為例說明技術(shù)要點： 1）細菌的分離A制備土壤稀釋液：稱取土樣1 g,在火焰旁加入盛有 99mL弁裝有玻璃珠的無菌水 或無菌生理鹽水錐形瓶中？振蕩1020mi n ,使土樣中菌體、芬抱或抱子均勻分散，制成10 -2稀釋度的土壤稀釋液，然后按10倍稀釋法進行稀釋分離。具體操作技術(shù)要點如下：取 4.5 mL無菌水試管6支，按

11、10-210-7順序編號，放置在試管架上。取無菌移液管一支，從移液管包裝紙?zhí)字虚g撕口，將包裝紙?zhí)追殖缮稀⑾聝啥?，去除下段包裝紙?zhí)祝谝埔汗苌隙斯芸谘b橡皮頭，取出下段移液管紙?zhí)追胖米烂?，以右手拇指、食指、中指拿住移液管卜端的橡皮頭，將吸液端口及移液管外部表面迅速通過火焰2? 3次，殺滅撕紙?zhí)讜r可能污染的雜菌，切忌不要用手指去觸摸移液管吸液端口及外部。左手持錐形瓶底，以右手掌及小指、無名指夾住錐形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞（棉塞夾在手上，不能亂放在桌上），將1mL移液管的吸液端伸進振蕩混勻的錐形瓶土壤懸液底部，用手指輕按橡皮頭，在錐形瓶內(nèi)反復(fù)吹吸二次（吹吸時注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面），

12、然后準確吸取 0.5mL 10 -2 土壤稀釋液（吸管插入稀釋液不低于 2.5cm反復(fù)沖洗10次左右，吸液高于所需要刻度少許，然后提起吸管貼于容器內(nèi)壁取出所需要體積；靠近液面但不接觸液面的情況下將液體緩慢吹出到第二個容器（第一級稀釋液所用吸管不得接觸第二級稀釋液），右手將棉塞插回錐形瓶上，左手放下錐形瓶，換持一支盛有4.5mL無菌水的試管，依前法在火焰旁拔除試管帽（或 棉塞），將0.5mL 10-2 土壤稀釋液注入 4.5mL無菌水試管內(nèi)，制成10-3的土壤稀釋液，將 此移液管通過 火焰再插入原來包裝移液管的下段紙?zhí)變?nèi)，以備再用。另取一只未用過的無菌移液管在試管內(nèi)反復(fù)吹吸三次，然后取出移液管，

13、弁將其通過火焰再插入原來包裝移液管的下段紙?zhí)變?nèi)，以備再用。蓋上試管帽。右手持10-3稀釋液試管在左手十敲打20? 30次。混勻土壤稀釋液。再從紙?zhí)兹〕鲈瓉淼囊埔汗?，插入稀釋液已很勻的試管?nèi)，再吹吸三次，然后準確吸出0.5mL 10 -3的稀釋液置于第二支裝有4.5 mL無菌水試管中，制成 10-4 土壤稀釋液。同法再制成10-5、10-6、10-7的土壤稀釋液（為避免稀釋過程誤差，進行微生物計數(shù)時，最好每一個稀釋度更換一支移液管）。用完的移液管重新放人紙?zhí)變?nèi)。最后應(yīng)該統(tǒng)一待滅菌后，再洗刷或?qū)⒂眠^的移液管放在廢棄物筒中？用3%-5麻蘇爾浸泡I h后再洗滌。B傾注法分離取無菌培養(yǎng)皿69套，分別于培

14、養(yǎng)皿底面按稀釋度編號。稀釋完畢后，可用原來的移液管從菌液濃度最小的10-7 土壤稀釋液開始吸取 1mL稀釋液，按無菌操作技術(shù)加到和應(yīng)編號的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。再依同方法分別吸取1mL I0-6、10-5的土壤稀釋液，各加到和應(yīng)編號為10-6、10-5的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。將已滅菌的肉膏蛋白豚固體培養(yǎng)基融化，待冷 卻至4550 C 左右（醫(yī)學標準的要求是 45 ±1 C ）,分別傾入到已盛有I0-5、10-6、10-7 土壤 稀釋液的無菌培養(yǎng)皿 內(nèi)。注意：溫度過圖易將菌燙死，且皿蓋上冷凝水太多，會影響 分離 效果；低于45 C培養(yǎng)基易凝固，平板易出現(xiàn)凝塊、高低不 平。用左 手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一

15、縫，至瓶口正好伸入，傾入培養(yǎng)基約12?15 mL,將培養(yǎng)皿在桌面上輕輕轉(zhuǎn)動（標準要求是：以約15cm直徑范圍，順時針方向輕輕移動平皿6次，再以15cm直徑范圍前后移動平皿6次，并重復(fù)往返1次），使稀釋的菌懸液與融化的瓊脂培養(yǎng)基混合 均勻.混勻后靜置桌上，待凝。C培養(yǎng) 待平板完全冷凝后，將平扳倒置于35 37 C恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)24?48h觀察結(jié)果。（2）放線菌、酪母的分離A制備土壤稀釋液稱取土樣I g ，加入盛有99mL弁裝有玻璃珠的無菌水或無菌生理鹽水錐形瓶中.弁加人10滴10姍溶液抑制細菌生長（也可用I %勺重銘酸鉀?§液代替 10%&溶液？效果更好）。振蕩后靜置5

16、min,即成10-2 土壤稀釋液。B1傾注法按前法將土壤稀釋液分別稀釋為10-3、10-4、10-5三個稀釋度，然后用無菌移液管依次分別吸取ImL 10 -5、I0-4、10-3 土壤稀釋液于對應(yīng)編號的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用 高氏合成1號培養(yǎng)基依前法傾倒平板，每個稀釋度做2? 3個平行培養(yǎng)皿。酯母分離時可選擇面曲溶解在生理鹽水內(nèi)，振蕩20min,即成10-2的面曲稀釋液。若選用果園土樣分離酪母，也依前法稱取土樣，制成10-2壤稀釋液。B2涂布法依前法向無菌培養(yǎng)皿中傾倒已融化弁冷卻至45-50 C的豆芬汁葡萄糖培養(yǎng)基，待平板冷凝后，用無菌移液管分別吸取上述I0-6、I0-5、10-4三個稀釋度菌懸液

17、0.1mL ,依次滴加于對應(yīng)編號已制備好的豆芬汁葡萄糖培養(yǎng)基平板上。右手持無菌玻璃涂棒，左手拿培養(yǎng)皿，弁用拇指將皿蓋打開一縫,在火焰旁右手持玻璃涂棒于培養(yǎng)皿平板表面將菌液自平* *板中央均勻向四周涂布擴散，切忌用力過猛將菌液直接推向平板邊緣或?qū)⑴囵B(yǎng)基劃破。C培養(yǎng)接種后，將平板 倒置于30 C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 2? 3d觀察酯母培養(yǎng)結(jié)果，57d觀察放線菌培養(yǎng)結(jié)果。1.2劃線分離法菌種被其他雜菌污染時或混合菌懸液常用劃線法進行純種分離。此法將嘛有混合菌懸液（10-2）的接種環(huán)在平板表面多方向連續(xù)劃線，使混雜的微生物細胞在平板表面分散，經(jīng)培養(yǎng)得到分散成由單個微生物細胞繁殖而成的菌落，從而達到純化目

18、的。平板制作方法如前所述。劃線分離的培養(yǎng)基必須事先傾倒好，需充分冷凝待平板稍于后方可使用；為便于劃線，一般培養(yǎng)基不宜太薄，每皿約傾倒20mL培養(yǎng)基（較之一般培養(yǎng)數(shù)量稍多），培養(yǎng)基應(yīng)厚薄均勻，平板表面光滑。同時，可以增加瓊脂的用量到22.5%。有必要時，應(yīng)該將平板放置于培養(yǎng)箱內(nèi)24小時左右，除去皿蓋上的水珠，弁使 平板的表面干燥。劃線分離主要有連續(xù)劃線法和分區(qū)劃線法兩種。（1） 連續(xù)劃線法 連續(xù)劃線法適用于菌濃度較低的樣品的分離。方法是從平板邊緣一點開始，連續(xù)作波浪式劃線直到平板的另一端為止，當中不需灼燒接種環(huán)上的菌。以無菌操作用接種環(huán)直接取平板上待分離純化的菌落。將菌種點種在平板邊緣一處，取出

19、接種，燒去多余菌體。將接種環(huán)再次通過稍打開皿蓋的縫隙伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷卻？然后從接種有菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線。劃線時平板面與接種環(huán)面成 30?40 °的角度，以手腕力量在平板表面輕巧滑動劃線。接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基，線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊）。劃線完畢，關(guān)上皿蓋。灼燒接種環(huán)，待冷卻后放置接種架上。培養(yǎng)皿倒置于適溫的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（可以免培養(yǎng)過程中皿蓋冷凝水滴下，重新混亂巳分離的菌落 ）。培養(yǎng)后在劃線平板上觀察沿劃線處長出的菌落形態(tài)，涂片鏡檢為純種后再接種斜面。（2） 分區(qū)劃線法平板分四區(qū)，故又稱四分區(qū)劃

20、線法，適用于菌濃度較高的樣品的分離。劃線時每次將平板轉(zhuǎn)動6070 °劃線，每換一次角度，應(yīng)將接種環(huán)上的菌燒滅后，再在上次劃線末尾處繼續(xù)劃線。取菌、接種、培養(yǎng)方法與連續(xù)劃線法相似。分區(qū)劃線法劃線分離的平板分4個區(qū)，其中第四區(qū)是單菌落的主要分布區(qū)，故其劃線面積應(yīng)最大。為防止第四區(qū)內(nèi)劃線與I、2、3區(qū)線條和接觸，應(yīng)使 4區(qū)線條與I區(qū)線條和平行，這樣區(qū)與區(qū)間線條夾角最好保持120 °左右。先將接種環(huán)沾取少量菌在平板1區(qū)劃3? 5條平行線，取出接種環(huán)，左手關(guān)上皿蓋？將平板轉(zhuǎn)動60? 70。，右手把接種環(huán)上多余菌體燒滅，將燒紅的接種環(huán)在平板邊緣冷卻，再按以上方法以1區(qū)劃線的菌體為菌源，

21、由1區(qū)向2區(qū)作第二次早行劃線。第二次劃線完畢，同時再把平皿轉(zhuǎn)動約 6070 ° ,同樣依次劃線。劃線完畢，灼燒接種環(huán)，關(guān)上皿蓋，同上法培養(yǎng)，在劃線區(qū)觀察單菌落。本次實驗可在分離細菌的平板上選取單菌落于肉膏蛋白陳平板上再次劃線分離,使菌進一步純化。劃線接種后的平板，倒置于 30 C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h后觀察結(jié)果。酯母及霉菌的分離方法基本步驟同上，但注意細菌、放線菌、霉菌時可采用傾注法，酪母菌分離采用涂布法。2微生物菌落計數(shù)（平板菌落計數(shù)法，細菌）說明：這一部分的內(nèi)容，可以結(jié)合1中的內(nèi)容一弁完成。含菌樣品的微生物經(jīng)稀釋分離培養(yǎng)后，每一個活菌細胞可以在平板上繁殖形成一個肉眼可見的菌落，

22、根據(jù)平板上菌落的數(shù)目，推算出每克含菌樣品中所含的活菌總數(shù)。每克菌樣品中微生物的活細胞數(shù)=（同一稀釋度的3個平板上菌落平均數(shù)x稀釋倍數(shù)）/含菌樣品克數(shù)。一般由三個稀釋度計算出的每克含菌樣品中的總活菌數(shù)和同一稀釋度出現(xiàn)的總活菌數(shù)均應(yīng)很接近，不同稀釋度平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)應(yīng)呈規(guī)律性地減少。如相差較大，表示操作不精確。菌落計數(shù)法要求計數(shù)平板中的菌落數(shù)以50300為準，通常以第二個稀釋度的平板上出現(xiàn)50個左右菌落為好。3其它要求完成的內(nèi)容3.1 平板菌落形態(tài)及個體形態(tài)觀察從不同平板上選擇不同類型菌落用肉眼觀察，區(qū)分細菌、放線菌、酯母菌和霉菌的菌落形態(tài)特征；用接種環(huán)試挑菌，看其與基質(zhì)結(jié)合緊密程度；用接種環(huán)挑

23、取不同菌落制片，在顯微鏡下進行個體形態(tài)觀察；記錄所分離的含菌樣品中明顯不同的各類菌株的主要菌落特征和細胞形態(tài)。3.2 分離純化菌株轉(zhuǎn)接斜面（斜面接種）在分離細菌、放線菌，酯母菌和霉菌的不同平板上選擇分離效果較好，認為已經(jīng)純化的操作時注意左手同時拿住平板與斜面試管,單人完成從平菌落各挑選一個用接種環(huán)接種斜面, 板至斜面的轉(zhuǎn)接。將細菌接種于肉膏蛋白陳斜面，放線菌接種于高氏1號斜面，酪母菌和霉菌接種于豆芬汁葡萄糖斜面上。貼好標簽，在各自適宜的溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)后觀察是否為純種，記錄斜面培養(yǎng)條件及菌苔特征。交驗后，值得保存的菌株置冰箱保藏，其余滅菌后，將器皿清洗交還實驗室。實驗報告1. 簡述分離微生物純種的原則及列