肉雞中沙門菌污染監(jiān)測

1、時間：二。二一年七月二十九日肉雞中沙門菌污染監(jiān)測之答祿夫天創(chuàng)作時間：二O二一年七月二十九日摘要目的 對肉雞養(yǎng)殖和屠宰環(huán)節(jié)進(jìn)行沙門菌監(jiān)測，確定肉雞在養(yǎng)殖和屠宰環(huán)節(jié)中沙門菌的污染狀況，分析肉雞中沙門菌的污染來源，為食品平安風(fēng)險評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時也為預(yù)防和控制由 沙門菌起的食源性疾病提供科學(xué)依據(jù).方法 在四川省成都會、遂寧市選取肉雞養(yǎng)殖場和屠宰場作為監(jiān)測點.收集肉雞活體肛拭、養(yǎng)殖場環(huán)境樣本，肉雞胴體，屠宰場環(huán)境樣本進(jìn)行沙門菌分離，并對檢出菌株運用脈沖場凝膠電泳（PFGE進(jìn)行分子分型，用微量肉湯稀 釋法進(jìn)行14種抗生素藥物敏感實驗.結(jié)果 共從2個肉雞屠宰場 和1個肉雞養(yǎng)殖場收集樣本 417份，檢出

2、沙門菌12株，檢出率為 2.87%.通過PFG的型，共獲得4個帶型.其中遂寧養(yǎng)殖場的1株環(huán) 境分離株和遂寧屠宰場的3株肉雞胴體分離株具有相同PFG理別,成都屠宰場的2株環(huán)境分離株和該屠宰場4株肉雞胴體分離株具有相似PFGE©別.遂寧分離的4株沙門菌對14種抗生素100%政 感.成都分離的8株沙門菌對14抗生素耐藥水平各異，其中4株沙 門菌能耐受3種以上藥物.結(jié)論 四川省部份地域肉雞在養(yǎng)殖和屠 宰環(huán)節(jié)存在沙門菌污染，且有多重耐藥菌株呈現(xiàn)，應(yīng)進(jìn)一步加年夜 監(jiān)測力度.沙門菌是引起食源性疾病的罕見致病菌之一.在自然界沙門菌分布廣泛，主要由于食入污染食品，引起感染性腹瀉.在全球范圍內(nèi)沙 門菌引

3、起的細(xì)菌性食物中毒都位居前列1,2,而且呈現(xiàn)上升趨勢.時間：二。二一年七月二十九日時間：二。二一年七月二十九日在我國招致細(xì)菌性食物中毒的致病菌中沙門菌位居首位3. 雞肉作為沙門菌污染的主要食物之一4, 監(jiān)測肉雞中沙門菌的來源、污染和耐藥狀況, 對因肉雞沙門菌污染招致食物中毒的風(fēng)險評估和預(yù)防、控制、治療沙門菌引起的食物中毒具有非常重要的意義. 近年來養(yǎng)殖中抗生素的過度和不正確使用招致植物中分離到耐藥沙門菌的情況越來越普遍, 且多重耐藥的沙門菌也多有報道5. 降低沙門菌對食品的污染是控制沙門菌食源性疾病的總要途徑之一. 通過溯源找出并消除污染源是防治沙門菌污染的有效手段. 基于脈沖場凝膠電泳(pu

4、lsed-field gel electrophoresis,PFGE )的細(xì)菌分子分型技術(shù)已被多個國家用于建立了細(xì)菌分子分型網(wǎng)絡(luò)及溯源平臺(PulseNet,Foodnet ) , 并以此分析食源性致病菌來源和傳布6 .現(xiàn)今PFGE已被認(rèn)為是沙門菌食物中毒的溯源分析的金標(biāo)準(zhǔn).根據(jù)“2010 年國家食品平安風(fēng)險監(jiān)測-肉雞沙門氏菌專項監(jiān)測”,在四川省內(nèi)選取養(yǎng)殖場和屠宰場作為監(jiān)測點, 以肉雞活體和屠宰后胴體作為監(jiān)測對象開展監(jiān)測工作, 監(jiān)測肉雞在飼養(yǎng)和屠宰過程中沙門菌的污染狀況，利用PFGE分子分型分析沙門菌的污染來源和擴(kuò)散途徑 , 檢測肉雞中沙門菌的耐藥狀況. 為四川省沙門菌風(fēng)險評估供可靠的基礎(chǔ)數(shù)

5、據(jù), 同時為預(yù)防和控制由沙門菌起的食源性疾病提供科學(xué)依據(jù).1 資料與方法1.1 監(jiān)測點的設(shè)立根據(jù)“國家食品平安風(fēng)險監(jiān)測 - 肉雞沙門氏菌專項監(jiān)測”要求 , 分別選取遂寧市規(guī)范化肉雞養(yǎng)殖加工企業(yè)的養(yǎng)殖時間：二。二一年七月二十九日時間：二。二一年七月二十九日場和屠宰場及成都會1 年夜型屠宰場進(jìn)行樣本收集. 監(jiān)測養(yǎng)殖和屠宰前活雞體內(nèi)和屠宰后雞胴體沙門菌帶菌狀況, 及養(yǎng)殖場和屠宰場環(huán)境中沙門菌污染狀況.1.2 樣品收集監(jiān)測點樣本收集依照“國家食品平安風(fēng)險監(jiān)測 -肉雞沙門氏菌專項監(jiān)測”提供方法 . 雞活體肛拭收集是將拭子輕輕旋轉(zhuǎn)拔出雞肛門內(nèi)約34 cm處，緊靠腸壁概況黏液后退出后迅速插回拭子管內(nèi)并擰緊螺

6、帽. 雞胴體收集是收集屠宰后深加工之前的胴體雞 . 養(yǎng)殖場中采用活雞肛拭, 養(yǎng)殖場環(huán)境樣本為采用多份雞場空中土壤和雞籠各部位概況涂抹拭子于同一采樣袋中作為1 份環(huán)境混合樣本. 屠宰場先采用屠宰前活雞肛拭, 再在屠宰后采用胴體雞 , 獨自包裝冷藏送回實驗室檢驗, 屠宰場環(huán)境樣本為宰場臺面各部位涂抹拭子和各種用具涂抹拭子于同一采樣袋中作為1 份環(huán)境混合樣本. 養(yǎng)殖場中收集雞活體肛拭45 份 , 雞養(yǎng)殖場環(huán)境樣本3 份 .屠宰場中收集雞活體肛拭171 份 , 雞胴體 176 份 , 屠宰場環(huán)境樣本12份 .1.3 菌株分離和鑒定樣品處置依照“食品平安風(fēng)險監(jiān)測 - 肉雞沙門氏菌專項監(jiān)測”提供方法 .

7、沙門菌分離鑒定參照食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗(GB 4789.4-2010). 疑似菌株生化鑒定采納全自動細(xì)菌生化鑒定儀(VITEK 32). 血清分型采納泰國S A 公司診斷血清.1.4 藥物敏感實驗分離獲得的沙門菌用微量肉湯稀釋法檢測最低抑菌濃度(MIC). 結(jié)果判定依照抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)時間：二。二一年七月二十九日時間：二。二一年七月二十九日準(zhǔn)2010版(M100-S20)判定，質(zhì)控菌株 ATCC2592既源于中國 CDC 營養(yǎng)與食品平安所.1.5 沙門菌PFG第型分析1.5.1 PFGE分型 沙門菌PFGE依照中國疾病預(yù)防控制中心推薦的 PlusNet的PFGE標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)

8、行6,標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812來源于中國細(xì) 菌性沾染病分子分型實驗室, 電泳以 H9812/Xba I 為 Marker. 取新鮮瓊脂培養(yǎng)物均勻懸濁于3ml 細(xì)胞懸液(100mM Tris-HCL,100 mMEDTA, pH=8.0)中，調(diào)節(jié)濃度，使其 OD值為4.04.2.取400區(qū)1菌 懸液37c孵育5 min,分別加入卵白酶K 20 l (貯存液濃度為 20mg/ml)至終濃度 0.5mg/ml,再與等體積 1% Seakem Gold瓊脂 混合 , 加入模具. 在室溫下凝固后取出膠塊加5ml 細(xì)胞裂解液(50mM Tris-HCL,50 mM EDTA, 1% 十二烷基肌氨酸鈉, 0.1m

9、g/ml卵白酶K , pH=8.0,), 混勻,54 C水浴輕搖 2h,轉(zhuǎn)速170rmp.50 C ddH2O水浴10min洗膠塊2次,TE 50 C水浴10min洗膠塊4次.切 2mm膠塊加入195區(qū)1酶切緩沖液中，再加入5屋Xba 1,37 C酶切 2h. 酶切好的膠塊粘在梳子上制膠、電泳, 電泳時泵設(shè)為70, 電泳溫度14C,電壓梯度 6V/cm,脈沖時間2.1663.80s,電場夾角 120° , 電泳時間19h. 電泳膠用GlodRed 染色 , 用 Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)獲取電泳結(jié)果.1.5.2 聚類分析數(shù)據(jù)分析利用BionumeriscV5.10 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚

10、類分析, 方法采納UPGM(A Unweighted Pair group Methodusing Arithmetic averages ) . 聚類相似性系數(shù)( 距離 ) 采納的是時間：二。二一年七月二十九日時間：二。二一年七月二十九日基于條帶比力的Dice. 根據(jù)聚類結(jié)果, 按分歧菌株的相似性系數(shù)進(jìn)行分型，相似系數(shù)即是100%勺分歧菌株為同一 PFG國.2 結(jié)果2.1 肉雞監(jiān)測沙門菌分布2010 年食品平安風(fēng)險監(jiān)測-肉雞沙門氏菌專項監(jiān)測中沙門菌分布見表1. 樣本采樣總量417 份 , 其中活雞肛拭子216 份 , 占監(jiān)測總量的51.8%, 屠宰后胴體186 份 , 占監(jiān)測總量的44.6%

11、, 環(huán)境樣本15 份 .8、 9 月于遂寧養(yǎng)殖場共采用3批樣本 , 遂寧屠宰場共采用6 批樣本.9、 10 月份于成都屠宰場共采用 6 批樣本 . 監(jiān)測中共檢出陽性菌株12 株 , 陽性率 2.87%. 遂寧養(yǎng)殖加工廠的養(yǎng)殖場環(huán)境中分離出1 株 , 屠宰后胴體中分離出3 株 .成都屠宰場2 批屠宰后胴體樣本中共分離獲得6 株沙門菌, 在屠宰場環(huán)境樣本中分離出了2 株沙門菌. 陽性樣本集中在屠宰后肉雞胴體中 , 屠宰后胴體陽性率4.84%.2 地屠宰場和養(yǎng)殖場的活雞肛拭樣本中都未檢出沙門菌.2.2 沙門菌血清分型經(jīng)血清分型將檢測獲得的菌株分為3 個血清型 . 在遂寧肉雞胴體和肉雞養(yǎng)殖場環(huán)境中分離

12、的4 株均為 D 群的山夫頓堡沙門菌. 在成都肉雞胴體中分離的6 株沙門菌中4 株為C2 群的布利丹沙門菌, 其余 2 株為 C1 群的巴森海德沙門菌. 成都屠宰場環(huán)境中分離的2 株均為布利丹沙門菌.2.3 沙門菌PFGE分子分型分離獲得的沙門菌經(jīng) PFGE分子分型獲得4個PFG理別.分歧血清學(xué)型的沙門菌株在PFG的型上也有明顯的區(qū)分（圖1 ） . 遂寧屠宰后胴體中分離獲得的3 株沙門菌和時間：二。二一年七月二十九日時間：二。二一年七月二十九日1株從遂寧養(yǎng)殖場環(huán)境中分離的沙門菌具有相同的PFGE型.而從成都屠宰場獲得的6株布利丹沙門菌可分為 2個PFG國,A型和B 型,2者間相似度到達(dá)92.8

13、6%,僅存在有4根條帶的不同.2株A型 的沙門菌均來自于成都屠宰場環(huán)境, 而 4 株 B 型的沙門菌均來自于成都屠宰場肉雞胴體. 從成都屠宰場中分離的的布利丹沙門菌和巴森海德沙門菌（C 型 ） 間相似度為69.33%, 而山夫頓堡沙門菌（D 型 ）與其他PFG國沙門菌相似度較低為 59.19%.2.4 沙門菌抗生素敏感實驗12 株沙門菌對14 種藥物的耐藥性狀況見表2. 在分離出的陽性菌株中, 遂寧分離出的4 株山夫頓堡沙門菌 （D 型 ） 均未呈現(xiàn)耐藥性, 而成都分離的8 株菌對萘啶酸均呈現(xiàn)分歧水平的耐藥.相同PFGE型的沙門菌也具有相似的的耐藥性（表3） .B型沙門菌主要對蔡咤酸具有抗性

14、，而C型和A型的沙門 菌都能耐受3種以上抗生素.C型和A型的沙門菌對青霉素類和磺 胺嘧啶都有很高的耐藥性. 除此之外,C 型還對復(fù)方磺胺類、四環(huán)素和氯霉素有較高的耐藥性.注：SDI:磺胺喀咤； SXT:甲氧節(jié)咤/磺胺甲惡噪； TET:四環(huán) 素；GEN慶年夜霉素；AMK阿米卡星；KAN卡那霉素；NAL蔡 咤酸；CIP環(huán)丙沙星；CHL氯霉素；AMP氨節(jié)青霉素；AMC阿莫 西林/克拉維酸；FEP:頭抱毗土虧；CTX頭抱曝歷；CRO頭抱曲 松.3 討論在自然環(huán)境中廣泛存在沙門菌, 而分歧地域沙門菌有其分布特點.時間：二。二一年七月二十九日時間：二。二一年七月二十九日從各個采樣點所獲沙門菌分布來看, 分

15、歧地址沙門菌血清型不同明顯 , 分歧區(qū)域有各自的沙門菌優(yōu)勢血清型. 在遂寧雞群中是山夫頓堡沙門菌, 而成都屠宰場中則是布利丹沙門菌. 成都屠宰場的肉雞胴體帶菌率高于遂寧屠宰場, 這可能源于2 地分歧的管理模式. 遂寧加工廠肉雞為自產(chǎn)自銷模式, 屠宰場雞群均來自其養(yǎng)殖場, 養(yǎng)殖和屠宰環(huán)節(jié)管理嚴(yán)格. 而成都屠宰場為來樣加工, 雞群來源于全省分歧肉雞養(yǎng)殖場, 分歧養(yǎng)殖場肉雞沙門菌污染率分歧, 污染的沙門菌種類也有分歧. 成都屠宰場在屠宰分歧來源肉雞時其間沒有明顯間隔 , 屠宰工作人員也沒有明確的職能區(qū)分, 因而易發(fā)生交叉污染.在成都屠宰收集的同一批肉雞胴體樣本中就分離出了布利丹沙門菌和巴森海德沙門菌

16、2 種分歧血清型的沙門菌. 因而分歧地域肉雞沙門菌污染狀況存在不同.基于PFGE技術(shù)的分子分型因與其他分型技術(shù)相比其區(qū)分度更強、重復(fù)性好, 在污染溯源分析和流行病學(xué)分析中獲得了廣泛應(yīng)用7,8.與傳統(tǒng)分型方法相比 PFGEM基因組層面對細(xì)菌進(jìn)行分型能獲得基于遺傳性狀的型別, 能更清楚簡直定分歧沙門菌菌株的親緣關(guān)系.在基于PFGE的聚類分析中發(fā)現(xiàn)，從遂寧屠宰后胴體中分離的3株沙門菌與養(yǎng)殖場環(huán)境中檢出的沙門菌PFG國相同（圖1）,而且屠宰的肉雞均來自與該養(yǎng)殖場, 可以確定遂寧監(jiān)測中獲得的沙門菌來源相同. 養(yǎng)殖場環(huán)境中的沙門菌是肉雞中沙門菌的重要污染源成都屠宰場沙門菌的來源復(fù)雜, 影響因素較多. 屠宰

17、后雞胴體的沙門菌污染則可能來源于屠宰場環(huán)境或肉雞.通過的PFGE分析發(fā)現(xiàn)，時間：二。二一年七月二十九日時間：二。二一年七月二十九日雖然屠宰場環(huán)境中檢出的A 型沙門菌與肉雞胴體中的B 型沙門菌PFGE型分歧（圖1）,但2亞型間僅有 4條帶不同.依據(jù)Tenover的判定標(biāo)準(zhǔn)9,2 型PFGE間約有2個自力基因的變異，PFGE之間仍可能具有親緣關(guān)系. 在屠宰過程中肉雞可能受到多方面的污染.屠宰過程中屠宰場環(huán)境可能會污染肉雞, 而帶菌的肉雞也可以與其他肉雞直接接觸或通過污染屠宰場環(huán)境招致其他肉雞帶菌. 肉雞養(yǎng)殖場所和屠宰環(huán)節(jié)為沙門菌污染的重要環(huán)節(jié), 對肉雞沙門菌污染來源的監(jiān)測特別是對屠宰環(huán)節(jié)需要制定更

18、細(xì)致的監(jiān)測方案和更多的監(jiān)測數(shù)據(jù).該監(jiān)測中所獲沙門菌的樣本類型分布情況中可以發(fā)現(xiàn), 沙門菌在養(yǎng)殖和屠宰環(huán)節(jié)中廣泛存在, 屠宰后肉雞胴體中沙門菌污染率較高.在屠宰過程中及屠宰后肉雞成批堆放增加了同群肉雞間交叉污染的風(fēng)險 . 沙門菌集中在3 批屠宰后胴體樣本中且相同批次中檢出的沙門菌常具有相同的PFGE,說明屠宰過程中存在交叉污染.活雞肛拭中未檢出與養(yǎng)殖中使用抗生素可能具有一定聯(lián)系. 抗生素的使用可以招致活體體內(nèi)帶菌率或帶菌量降低而難以檢出. 在以后監(jiān)測中應(yīng)考慮檢驗肉雞中的抗生素殘留.細(xì)菌耐藥性的逐年提高以及多重耐藥甚至超級細(xì)菌的呈現(xiàn)對生物平安的影響已經(jīng)引起很全球的警惕. 在以往的監(jiān)測中越來越多的多

19、重耐藥沙門菌被發(fā)現(xiàn)5, 而我國沙門菌耐藥狀況也不容樂觀10.在我國養(yǎng)殖業(yè)中抗生素濫用情況嚴(yán)重, 抗生素的不正確和過度使用普遍存在. 這也加劇了耐藥細(xì)菌的發(fā)生和多重耐藥菌的呈現(xiàn). 四川時間：二。二一年七月二十九日時間：二。二一年七月二十九日地域以往的檢測中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能耐受從基本到高端各種抗生素的沙門耐藥菌株11. 調(diào)查食品中的沙門菌的耐藥趨勢和耐藥譜, 對立生素的合理運用和防止耐藥菌株的傳布具有重要意義.在這次監(jiān)測中, 分歧地域分離獲得的菌株耐藥性不同較年夜. 遂寧獲得的 4 株沙門菌對14 種抗生素均未呈現(xiàn)耐藥性（表2） , 這有賴于其規(guī)范化的養(yǎng)殖管理以及養(yǎng)殖中抗生素的合理使用. 而在成都屠宰場