G418的用途及配制方法

1、v1.0可編輯可修改G418的用途及配制方法G418 :白色粉末，融點(diǎn) 138144C,溶于水、甲醇。CAS No.：分子式：C20H40N4O10? 2H2SO4 分子量：比旋：+104o+121o水分：工 10% 吸光值：& (280nm,1mg/ml), & (570nm,100mg/ml)G418是一種氨基糖類抗生素, 其結(jié)構(gòu)與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它通過 影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對原核和真核等細(xì)胞都有毒性，包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動物細(xì)胞，也包括原生動物和蠕蟲。是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的選擇試劑。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后，則能啟

2、動neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為 mRNA從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖甘磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。G 418的這一選擇特性，已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動物等方面得以廣泛應(yīng)用。G418有殺菌作用，本身有很好的殺菌效果，在用G418進(jìn)行篩選的過程中很少會發(fā)生污染.G418和篩選篩選之前由于每種細(xì)胞對 G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。 具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個細(xì)胞/mL,在100ug/mL1mg/mL的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在101

3、4天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗。由于每種細(xì)胞對 G418的敏感性不同，一般變動在100ug/ml1000ug/ml范圍。而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的 G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定細(xì)胞對這一批G418的最佳篩選濃度。 盡管如此，特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是穩(wěn)定的。分子克隆給出了幾個常用細(xì)胞系所需G418的最佳用量。v1.0可編輯可修改細(xì)胞系或機(jī)體G418 濃度(ug/ml )中國倉鼠卵巢細(xì)胞700800Madin-Darby犬腎細(xì)胞500人上皮A431細(xì)胞400猿CV-1細(xì)胞500盤基網(wǎng)柄菌屬1035植物10酵母125500加藥時間

4、由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早； 但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆， 一般要在轉(zhuǎn)染 24小時之后才開始加 G418篩選。隨 著細(xì)胞的代謝 G418的濃度和活性都會下降， 所以每35天都要更換一次含有 G418的篩選液。這 時藥物濃度可以降至 200ug/ml。培養(yǎng)液加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無幾。這時會出現(xiàn)兩個問題：1 .死亡的細(xì)胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡。2 .孔中細(xì)胞數(shù)目很少，

5、細(xì)胞之間的信號會變得很弱，也會導(dǎo)致陽性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到 80%勺時候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1 : 1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。挑選單克隆的優(yōu)化為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來篩選陽性克隆。加藥后，在高倍鏡下，陽性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn)，在陽性克隆下用記號筆做個標(biāo)記。然后刮除隱性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)；或則用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化，

6、把消化液吸到另外一個新的v1.0可編輯可修改孔中培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。鑒定之后一般經(jīng)過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了，而且是隨機(jī)整合，會導(dǎo)致表達(dá)的目的蛋白的量產(chǎn)生很大差異。隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)， 那些丟失了外源基因的細(xì)胞和很少表達(dá)目的基因的細(xì)胞會占據(jù)優(yōu)勢，強(qiáng)表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞會越來越少。這樣再次篩選是必不可少的。 只有經(jīng)過2次以上的篩選之后才能找到那種我們想要的強(qiáng)分泌目的蛋白的，遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES夜

7、中，加蒸儲水至 10ml,過濾消毒，4度保存。2 .細(xì)胞培養(yǎng)：取待測培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 6小時左右開始加藥。3 .制備篩選培養(yǎng)基：在100ug/ml 1000ug/ml范圍內(nèi)確定幾個梯度，比如先做個 100ug/ml、 400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml ,按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。4 .加G418篩選：吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。5 .換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每35天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同 4。6 .確定最佳篩選濃度：在篩選1014天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小

8、G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳 G418濃度的可能性不大，最有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度 G418 的量在篩選14天后還不能殺死細(xì)胞， 而用下一個梯度的 G418的量在10天前就看不到活細(xì)胞了。假如是400ug/ml不能殺死細(xì)胞，而 800ug/ml在第5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒?，則可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml進(jìn)一步篩選，以確定最佳篩選濃度！心得：由于特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是比較穩(wěn)定的，所以有時候不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，現(xiàn)在我告訴你我測試過NIH3T3細(xì)胞對G418的敏感性，我用的篩選濃度是v1.0可編輯可修改200 ug/ml。這時你就可以做 150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三個濃度進(jìn)行篩選。通過預(yù)實驗確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了。a轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 24小時或者更長，到細(xì)胞增長接近匯合時按1 : 4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至50 %70 %匯合時；b加G418:去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基。c換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每35天更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時，可以把G418濃度減半維持篩選。篩選1014天后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)