β-內(nèi)酰胺酶在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及臨床意義

1、B-內(nèi)酰胺酶在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及臨床意義背景肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC) 簡(jiǎn)稱為肝癌,是消化系統(tǒng) 最為常見的原發(fā)性惡性月中瘤。相關(guān)調(diào)查顯示，每年約有100萬新發(fā)的肝細(xì)胞肝癌 的病例被檢測(cè)出來，其中，超過三分之二的新病例分布在西太平洋地區(qū)1。肝細(xì)胞肝癌的死亡率居全球第二位，最新研究數(shù)據(jù)顯示，在全世界由惡性月中 瘤造成的死亡事件中，肝細(xì)胞肝癌所占的比例最高2。HCCM有起病隱匿、高度 惡性和快速進(jìn)展的特征，且HCC患者的早期診斷仍是一個(gè)尚未被攻克的巨大挑戰(zhàn)。大多數(shù)患者在月中瘤已發(fā)展為晚期時(shí)才得到明確診斷，而HCC勺常用治療方案 如外科切除、肝移植、射頻消

2、融等手術(shù)治療的禁忌癥較多，因此，通過上述手術(shù)療 法來達(dá)到根治肝癌的目標(biāo)的幾率很低3,4。有研究顯示HCC臺(tái)療后的1年總體 生存率較為良好，為66.1%,而3年、5年總體生存率則分別降至39.7% 32.5%; 在早期 HCO者中分別為 93.5%、70.1%?口 59.1%5。但由于缺乏靈敏的早期診斷方法，HCC的病死率依然很高。鑒于目前 HCC臺(tái) 療方法尚未被攻克的局限性，確定HCCS生的分子機(jī)制并開發(fā)新的早期診斷和預(yù) 后預(yù)測(cè)策略至關(guān)重要。越來越多的證據(jù)表明，代謝失調(diào)尤其是異常脂質(zhì)代謝在包括 HCCS內(nèi)的月中瘤 進(jìn)展中發(fā)揮著巨大作用6-9。B -內(nèi)酰胺酶(beta-lactamase,LAC

3、TB)主要位于哺 乳動(dòng)物有核細(xì)胞的線粒體內(nèi)，在人體的不同組織中普遍存在，特別是在骨骼、心臟、 肌肉和肝臟。作為哺乳動(dòng)物活性位點(diǎn)絲氨酸蛋白，LACTB與細(xì)菌青霉素結(jié)合蛋白在進(jìn)化上 相關(guān)。LACTBM作為線粒體內(nèi)膜組織和能量穩(wěn)態(tài)白調(diào)節(jié)因子參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，繼而抑制月中瘤進(jìn)展，同時(shí)作為細(xì)胞代謝過程的新型蛋白酶同源物起作用10。此外，研究表明LACTBft一些惡性月中瘤如乳腺癌11、膠質(zhì)瘤12、胃癌13 和結(jié)直腸癌14,15中的表達(dá)低于癌旁組織，過表達(dá)LACTBT以抑制月中瘤細(xì)胞的 增殖。以上研究表明LACTB作為一種新型的表觀遺傳沉默月中瘤抑制因子，在月中 瘤的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。然而,LACT

4、B在HCCfr的表達(dá)情況和功能作用在很大程度上仍未被探索。目的1.探究LACTBft肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)水平的具體情況：分析TCG徽據(jù)庫中 LACTB mR#肝癌及癌旁組織中的轉(zhuǎn)錄水平是否有差異，以及LACTB mR浜錄 水平與肝癌患者TN/期、病理學(xué)分級(jí)和整體生存率(Overall survival rate,OSR)的相關(guān)性；探究LACTB&鄭州大學(xué)隊(duì)列的肝癌及癌旁組織中的表達(dá) 水平是否有差異，以及LACTBft達(dá)水平與肝癌患者TNM&期、病理學(xué)分級(jí)和整體 生存率的相關(guān)性；2.探究過表達(dá)LACTB寸肝癌細(xì)胞的表型的影響：體外過表達(dá) LACTB寸肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和彳！襲等生物

5、學(xué)行為的影響；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過表達(dá)LACTB寸裸鼠成瘤能力的影響。方法:1.下載TCGA(the cancer genome atlas) 數(shù)據(jù)庫中肝癌患者的臨床信 息以及LACTB mRN錄水平相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選和整合，分別分析LACTB mRNA 肝癌及配對(duì)的癌旁組織中的轉(zhuǎn)錄水平,及LACTB mRN錄水平與肝癌患者TNM 分期、病理學(xué)分級(jí)和總生存率的相關(guān)性。2.選取341例肝細(xì)胞肝癌患者的組織標(biāo) 本，這些患者于2011年至2015年就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，且經(jīng)過病理診斷 確診為肝癌。利用這些標(biāo)本構(gòu)建組織微陣列(Tissue microarray,TMA) 備用。3.采取免疫 組織化學(xué)(I

6、mmunohistochemical,IHC)染色法檢測(cè)臨床組織樣本中 LACTE©白質(zhì)表達(dá)水平，并分析肝癌組織中LACTBfe達(dá)水平與患者的臨床病理特征的相關(guān)性及 其對(duì)肝癌預(yù)后的影響。4.利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)LACTB并經(jīng)蛋白印跡方法確認(rèn)后，采取CCK-8 實(shí)驗(yàn)、EdU染色實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的增殖能力，采取細(xì)胞劃痕實(shí) 驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。5.采用表達(dá)LACTB勺肝癌 細(xì)胞注射到裸鼠皮下，利用活體成像儀記錄皮下腫瘤的生長速度，6周后處死小 鼠取出月中瘤，并利用IHC方法檢測(cè)LACTBS Ki-67的表達(dá)情況。6.采用GraphPad

7、Prism軟件（7.0版）和SPS漱件（版本23.0）分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。 采用卡方檢驗(yàn)來檢測(cè)LACTB8達(dá)水平與肝癌患者臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，采用 t檢驗(yàn)用于比較組間差異；采用Kaplan-Meier生存分析探究不同的LACT眼達(dá)水 平對(duì)肝癌預(yù)后的影響。結(jié)果:1.TCGA分析結(jié)果顯示,LACTB mRN的肝癌組織中的表達(dá)水平比正常組 織明顯降低；LACTB的表達(dá)水平在具有高病理學(xué)分級(jí)的患者中顯著低表達(dá) ，而在 不同TNMffiW;患者中LACTB勺表達(dá)水平則未表現(xiàn)出明顯的差異。2.Kaplan-Meier分析顯示LACT日氐表達(dá)的肝癌患者總體存活率（Overall survival,OS）和無復(fù)

8、發(fā)生存率（Relapse-free survival,RFS） 顯著低于 LACTEW 表達(dá)的患者。GSE期析結(jié)果顯示，與肝癌患者生存負(fù)相關(guān)的基因顯著富集于 LACT日氐表達(dá) 組，相反，與肝癌存活正相關(guān)的基因顯著富集于 LACTEW表達(dá)組。3.免疫組化染色 結(jié)果顯示肝癌組織中LACTEg白表達(dá)水平顯著低于配對(duì)的癌旁組織；LACTB表達(dá) 在TN/期I-II和III-IV 之間存在顯著差異，并且在高TNg級(jí)的組織中表達(dá) 更低。4 .LACTB低表達(dá)的肝癌患者總體存活率（OS）顯著低于LACTBW表達(dá)的患者。由單、多因素分析可知，低表達(dá)LACTBffi高級(jí)別TN*期是肝癌患者獨(dú)立預(yù)后危 險(xiǎn)因素。5 .體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，過表達(dá)LACTBT以顯著抑制肝癌細(xì)胞在體外的 增殖、遷移及侵襲能力。6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)LACTB寸于肝癌細(xì)胞在體 內(nèi)的