質(zhì)粒DNA的小量提取與DNA瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)報(bào)告

1、質(zhì)粒DNA勺小量提取及DNAg脂糖凝膠電泳一、前言質(zhì)粒質(zhì)粒是附加到細(xì)胞中的非細(xì)胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復(fù)制的較小的DN陰子（即細(xì)胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的 質(zhì)粒雖然都是環(huán)狀構(gòu)型，它存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物 （多為 原核生物）中，乃至于植物的線粒體等胞器中。然而， 1984年，在 Streptomyces coelicoler（天藍(lán)色鏈霉菌）等放線菌以及在 Borreliahermsii（赫氏婢疏螺旋體）等原核生物中，又相繼發(fā)現(xiàn)線形質(zhì)粒。天然質(zhì)粒的DN張度從數(shù)千堿基對(duì)至數(shù)十萬(wàn)堿基對(duì)都有。 質(zhì)粒天 然存在于這些生物里面，有時(shí)候一個(gè)細(xì)胞里面可以同時(shí)有一種乃至于 數(shù)種的質(zhì)粒同時(shí)

2、存在。質(zhì)粒的套數(shù)在細(xì)胞里從單一到數(shù)千都有可能。 有時(shí)有些質(zhì)粒含有某種抗藥基因（如大腸桿菌中就有含有抗四環(huán)素基 因的質(zhì)粒）。有一些質(zhì)粒攜帶的基因則可以賦予細(xì)胞額外的生理代謝 能力，乃至于在一些細(xì)菌中提高它的致病力。一般來(lái)說(shuō)，質(zhì)粒的存在 與否對(duì)宿主細(xì)胞生存沒有決定性的作用。 它是基因工程最常見的運(yùn)載 體。質(zhì)粒在細(xì)胞的復(fù)制一般有兩種類型：緊密控制型和松弛控制型。 前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)染色體不復(fù)制時(shí)，它也不能復(fù)制，通常每個(gè)細(xì)胞只含有一個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子，如 F因子。后者 的質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制，在每個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝，.專業(yè)資料. 一般在20個(gè)以上，如Col E1質(zhì)粒。在使

3、用蛋白質(zhì)合成抑制劑-氯霉 素時(shí)，細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、染色體 DN儂制和細(xì)胞分裂均受到抑制，緊 密型質(zhì)粒復(fù)制停止，而松弛型質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制，質(zhì)?？截悢?shù)可由原來(lái)20多個(gè)擴(kuò)增至1000-3000個(gè)，此時(shí)質(zhì)粒DNA占總DNA勺含量可由原 來(lái)的2%曾加至40-50%把一個(gè)有用的目的DNA>t段通過(guò)重組DNAK術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中 去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫載體。細(xì)菌質(zhì)粒是重組 DNA技術(shù)中常用 的載體。質(zhì)粒分子本身是含有復(fù)制功能的遺傳結(jié)構(gòu)。 質(zhì)粒還帶有某些 遺傳信息，所以會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 其自我復(fù)制能力及所 攜帶的遺傳信息在重組DNAft作，如擴(kuò)增、篩選過(guò)程中都是極為有用 的。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒

4、的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工 構(gòu)建的。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇 性標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因）和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性 切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列，并去掉了大部分非必需序列，使分 子量盡可能減少，以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用 途的輔助序列，這些用途包括通過(guò)組織化學(xué)方法肉眼鑒定重組克隆、 產(chǎn)生用于序列測(cè)定的單鏈DNA體外轉(zhuǎn)錄外源DNAff列、鑒定片段的 插入方向、外源基因的大量表達(dá)等。一個(gè)理想的克隆載體大致應(yīng)有下 列一些特性：分子量小、多拷貝、松弛控制型；具有多種常用的限 制性切酶的單切點(diǎn)；能插入較大的外源 DNA片段；具有兩個(gè)以上 的遺

5、傳標(biāo)記物，便于鑒定和篩選。對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)害。常用的質(zhì)粒載.專業(yè)資料. 體大小一般在1kb至10kb之間，如PBR322 PUC（歹J、PGE陳列和 pBluescript（簡(jiǎn)稱 pBS）等。質(zhì)粒的不兼容性利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中共同存在， 當(dāng)兩種質(zhì)粒同時(shí)導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí)，它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的 過(guò)程中彼此競(jìng)爭(zhēng)，在一些細(xì)胞中，一種質(zhì)粒占優(yōu)勢(shì)，而在另一些細(xì)胞 中另一種質(zhì)粒卻占上風(fēng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)丟失， 因而在細(xì)胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種， 這種現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性。瓊脂糖凝膠從瓊脂中除去帶電荷的瓊脂膠后， 剩下的不含磺酸基團(tuán)、竣酸基 團(tuán)等帶電荷基團(tuán)的中

6、性部分，結(jié)構(gòu)是鏈狀的聚半乳糖，易溶于沸水， 冷卻后可依靠糖基間的氫鍵引力形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。凝膠的網(wǎng)孔大小和凝膠的機(jī)械強(qiáng)度取決于瓊脂糖濃度。因此瓊脂糖凝膠可作為分子 篩，常用于凝膠層析和電泳。從瓊脂中除去帶電荷的瓊脂膠后，剩下的不含磺酸基團(tuán)、竣酸基團(tuán)等帶電荷基團(tuán)的中性部分， 結(jié)構(gòu)是鏈狀 的聚半乳糖，易溶于沸水，冷卻后可依靠糖基間的氫鍵引力形成網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)的凝膠。凝膠的網(wǎng)孔大小和凝膠的機(jī)械強(qiáng)度取決于瓊脂糖濃度。 因此瓊脂糖凝膠可作為分子篩，常用于凝膠層析和電泳。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。 其分析 原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有"分子篩&qu

7、ot;和"電泳"的雙 重作用。.專業(yè)資料.瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過(guò)時(shí)會(huì)受到阻力，大分子 物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不 僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提 高了分辨能力。但由于其孔徑相比于蛋白質(zhì)太小，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái) 說(shuō)其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。蛋白質(zhì)和核酸會(huì)根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場(chǎng)中受力大小 不同，因此跑的速度不同，根據(jù)這個(gè)原理可將其分開。電泳緩沖液的 pH在69之間，離子強(qiáng)度0.020.05為最適。常用1%勺瓊脂糖作為 電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DN*段

8、，其分辨率 雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離圍廣。普通瓊脂糖凝膠 分離DNA勺圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)10八7bp的DNA 片段。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由 于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈 DNA幾乎具有 等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA2 .學(xué)習(xí)和掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理和基本操作。三、實(shí)驗(yàn)原理.專業(yè)資料.1 .質(zhì)粒dnA勺小量提取堿裂解法是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNAJ線性染色體

9、DNA勺變性 與復(fù)性的差異達(dá)到分離的目的。在強(qiáng)堿性條件下，染色體DNA勺氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變 性，質(zhì)粒DNAC部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ) 鏈不會(huì)完全分離，彼此互相盤繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)將 pH 調(diào)到中性并有高濃度鹽存在時(shí)，變性質(zhì)粒DNAZ回復(fù)到原來(lái)的結(jié)構(gòu)保 存在溶液中，而染色體DNAF能復(fù)性，相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 通過(guò)離心，染色體DNAW不穩(wěn)定白大分子DNA蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等 一起沉淀下來(lái)而被除去。提取的質(zhì)粒DNA1用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純 化。2 .DNA瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是最常用的鑒定 DNA勺方法，它簡(jiǎn)便易行，只需 少量DNA瓊脂糖

10、是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔， 凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DN砌子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。DNA 分觀察瓊脂糖凝膠中DNA勺最簡(jiǎn)便方法是利用熒光染料澳乙錠（EB） 染色，EB在紫外燈照射下，發(fā)紅色熒光，本實(shí)驗(yàn)使用 Goldview。四、實(shí)驗(yàn)器材和材料試劑.專業(yè)資料.1 .實(shí)驗(yàn)材料菌種：含質(zhì)粒PET28a的大腸桿菌2 .實(shí)驗(yàn)試劑：(1)溶液I :50mmol/L葡萄糖溶液25mmol/L Tris-Cl (pH8.0)10mmol/L EDTA (pH8.0)(2)溶液 II : 0.4mol/L NaOH, 2%SDS用前兩者等體積混合，需新鮮

11、配制(3)溶液 III:3mol/L 的乙酸鉀 (pH4.8 )3mol/L 乙酸鉀 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml(4)酚/氯仿試劑：V (酚)：V (氯仿，含1/24異戊醇)=1:1(5) TE緩沖液10mmol/L Tris-Cl (pH7.4-8.0)1mmol/L EDTA (pH8.0)(6) LB培養(yǎng)基蛋白月東 10g酵母浸出粉5gNaCl 10g.專業(yè)資料.溶解在1L水中，調(diào)pH至7.2 , 121c高壓蒸汽滅菌20min(7)氨節(jié)青霉素(Amp :使用濃度為50-100ug/ml(8) pH8.0 TAE 緩沖液(9)凝膠上樣緩沖液：0.2%澳酚藍(lán)，50媾糖(9

12、) )瓊脂糖(11) 1mg/ml EB 溶液(12) Marker(13) PCRT增特異DNAt段3.實(shí)驗(yàn)器材：(8)微波爐(9)水平儀(10) 一次性手套(11)錐形瓶(12)量筒(13) tip(1) Eppendorf 管(2)移液器(3)恒溫培養(yǎng)箱(4)低溫高速離心機(jī)(5)渦旋混合器(6)水平電泳梢(7)紫外檢測(cè)儀五、實(shí)驗(yàn)操作質(zhì)粒DNA勺小量提取1 .菌種培養(yǎng)將含PET28a的大腸桿菌接種于LB(含Amp中，37c振蕩培養(yǎng) 過(guò)夜。.專業(yè)資料.2 .質(zhì)粒提取(1)取1.5ml培養(yǎng)液倒入Eppendorf管中，4C,8000rpm,離心 5min。(2)棄上清，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。(

13、3)將菌體沉淀懸浮于100ul溶液I中，用渦旋振蕩器振蕩1min, 置冰浴10min。(4)加200ul溶液II ,蓋緊管口，快速來(lái)回顛倒3次，使容物 充分混合，不要振蕩，至冰浴中 3min。(5)加150ul溶液III (冰上預(yù)冷)，蓋緊管口，顛倒數(shù)次并 輕輕振蕩混勻，冰浴5min。(6) 4C, 12000rpm,離心 5min,將上清液移入另一 Eppendorf 管中。(7)向上清液中加入等體積酚/氯仿(1:1),用渦旋振蕩器振 蕩 1-2min , 4 C , 10000rpm,離心 2min,將上清液移入另一 Eppendorf 管中。(8)加入等體積氯仿，重復(fù)上面的操作。(9)加

14、入1/10體積的2.5mol/L乙酸鈉，再加2倍體積的無(wú)水 乙醇，混勻后室溫放置5min, 4C, 12000rpm,離心15min,棄上清， 將Eppendorf管倒扣在吸水紙上，吸干液體。(10)加1ml70叱醇振蕩漂洗沉淀，4 C , 12000rpm,離心2min, 棄上清。(11)將Eppendorf管倒扣在吸水紙上，使乙醇流盡，空氣中干.專業(yè)資料.(12)加10U1TE緩沖液,-20C保存。DNA©脂糖凝膠電泳1 .瓊脂糖凝膠的制備稱取0.45g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入 30ml TAE緩沖液，保 鮮膜封口，置微波爐加熱至完全澄清透明取出搖勻，瓊脂糖的濃度為 1.5%。

15、待瓊脂糖凝月容液冷卻至50C,再加入1.5u1 goldview ,使 其終濃度為0.5ug/毫升。2 .凝膠板的制備用制膠器將紫外透光凝膠盤固定好，采用水平儀調(diào)整平衡使凝膠 盤位于同一水平面。將適宜的梳子垂直架在凝膠盤梢的一端，使梳齒距玻璃板之間尚有0.5-1mm的距離。將冷到50c左右的瓊脂糖凝膠，緩緩倒入凝膠盤梢，厚度適宜 (注意不要有氣泡)。3 .點(diǎn)樣待凝膠凝固后，小心取出梳齒，將凝膠盤放入電泳梢內(nèi)。加入足 夠的TAE電泳緩沖液，使液面略高出凝膠面。取5微升PCRT增產(chǎn)物，向其中加入1微升的上樣緩沖液，混勻 后用移液器將其加入加樣孔，記錄樣品點(diǎn)樣次序與點(diǎn)樣量。4 .電泳.專業(yè)資料.接通

16、電泳梢與電泳儀的電源，調(diào)節(jié)電壓 120V,當(dāng)澳酚藍(lán)染料移動(dòng) 到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。5 .觀察在紫外燈下觀察凝膠，有DNAM應(yīng)顯出橘紅色熒光條帶。記錄電 泳結(jié)果。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1 .實(shí)驗(yàn)結(jié)果:2 .實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察：上圖中從最左邊marker開始第6、7為我和與我同組的同學(xué)的點(diǎn)樣結(jié)果。可看出第6個(gè)明顯條帶亮度要低于旁邊的多數(shù)條帶，但第7個(gè)條帶亮度卻與旁邊的條帶相差不多。但這兩個(gè)均存在很嚴(yán)重的拖帶現(xiàn)象。.專業(yè)資料.七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.加入溶液II后快速來(lái)回顛倒，不要振蕩。2,加入溶液III后輕輕振蕩。3 .吸取上清時(shí)切勿吸到中間層。4 .倒膠時(shí)把握好膠的溫度，不要高于 60 C ,否

17、則溫度太高會(huì)使 凝膠盤變形。5 .膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要豎直向上，不要弄壞 點(diǎn)樣孔。6 .點(diǎn)樣時(shí)槍頭下伸，點(diǎn)樣孔不能有氣泡。7 .在用苯酚、氯仿抽提時(shí)應(yīng)用 TE緩沖液將原溶液的體積擴(kuò)大， 一般是200300微升，以減少DNA勺損失。8 .在加入酚氯仿的步驟中，最好用未高溫滅菌的離心管，因?yàn)楦?溫過(guò)程中可能使管口變形，使得振蕩混勻過(guò)程中酚氯仿容易溢出。9 .溶液II不可冷凍，現(xiàn)用現(xiàn)配。10 .在加入等量的酚氯仿離心后，離心管三層物質(zhì)，從上至下依次 為DNAk清液,蛋白質(zhì)，酚氯仿。11 .50%的乙醇可溶解 DNA故應(yīng)該極其注意 70%勺乙醇是否蓋子 完好，否則稀釋的乙醇有可能將所獲

18、得 DNA容解掉。八、思考題1 .溶液I、II、III的作用分別是什么？溶液I：由葡萄糖，EDTA,Tris Cl組成.葡萄糖的作用是增加溶液,專業(yè)資料. 的粘度，減少抽提過(guò)程中的機(jī)械剪切作用，防止破壞質(zhì)粒DNA;EDTA勺 作用是絡(luò)和掉Mg2痔二價(jià)金屬離子，防止DNA1對(duì)質(zhì)粒分子的降解作 用;Tris Cl能使溶菌液維持溶菌作用的最適 PH圍.溶液II:由SDSW NaOFfi成.SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白 質(zhì)分子結(jié)合使之變性；NaOH(pH>12羽作用是破壞氫鍵，使DNA分子變 性.溶液III:由KAc與HAc組成，是pH值為5.5的高鹽溶液.能中和 溶液II的堿性，使染色體DN儂性而發(fā)生纏繞并使質(zhì)粒 DNA更性.K+ 離子會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去.溶液中的染色體DN岫會(huì)與蛋白質(zhì)-SDS形成相互纏繞的大分子物質(zhì)，很容 易與小分子的質(zhì)粒 DNA分離,此外,高鹽溶液也有利于各種沉淀的形 成.2 .為什么加入溶液II后不要振蕩？因?yàn)槿芤篒I的作用是細(xì)胞裂解液，如果加入II液后劇烈搖動(dòng)， 很