人類ERMAP基因在不同胎齡胎兒組織中表達(dá)的研究

1、人類ERMAP基因在不同胎齡胎兒組織中表達(dá)的研究 作者：何新榮，何映誼，陳瀅，葉鐵真【摘要】 人類ERMAP基因是新近發(fā)現(xiàn)的編碼紅細(xì)胞膜相關(guān)蛋白基因，其功能可能與紅系造血活動(dòng)有關(guān)。為探討該基因在胎兒造血過程中的作用，收集9-36周難免流產(chǎn)胎兒共29例，分別抽提其肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺臟、胸腺、大腦、骨髓和肌肉等9種臟器組織的RNA，取其中胎齡25+5周（25周過5天，下同）的胎兒各臟器組織的RNA進(jìn)行Northern blot檢測，了解人類ERMAP基因在胎兒臟器組織中的表達(dá)譜，同時(shí)采用熒光定量PCR（FQ-PCR）方法觀察該基因在不同胎齡胎兒組織中表達(dá)量的變化規(guī)律。結(jié)果Northern

2、blot檢測顯示，人類ERMAP基因在25+5周胎兒肝臟和骨髓中表達(dá)陽性，而在脾臟、腎臟、胸腺、心臟、肺臟、大腦及肌肉中表達(dá)陰性。FQ-PCR結(jié)果顯示，人類ERMAP基因在9-36周胎兒肝臟中均有表達(dá)，其表達(dá)量從第12周開始升高，18-20周達(dá)高峰，21周后逐漸下降；該基因在胎兒骨髓中的表達(dá)則從15周開始，27-32周達(dá)高峰，之后迅速下降，其表達(dá)量低于肝臟；在其余7個(gè)臟器中僅有部分標(biāo)本呈現(xiàn)低水平表達(dá)。結(jié)論：人類ERMAP基因在胎兒肝臟中的表達(dá)規(guī)律與胎兒肝臟造血過程基本一致，在15-32周胎兒骨髓中的表達(dá)規(guī)律與胎兒期骨髓造血活動(dòng)基本吻合，推測該基因的功能可能與胎兒發(fā)育過程中紅系細(xì)胞向肝臟和骨髓的

3、遷移活動(dòng)有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 ERMAP基因；胎兒期；肝臟；骨髓；造血Expression of Human ERMAP Gene in Fetal TissuesAbstractHuman ERMAP (hERMAP) is a novel gene coding for erythroid membrane-associated protein, which may play a role in erythropoiesis. To explore the role of hERMAP in fetal hematopoiesis, 29 fetuses of inevitable abor

4、tion with the fetal ages of9-36 weeks were collected, and the total RNAs were isolated from the liver, spleen, kidney, heart, lung, thymus, brain, bone marrow and skeletal muscle, the RNAs from which at 25+5 week fetal age were used to detect hERMAP expressions in different fetal tissues with Northe

5、rn blot, and the hERMAP in various fetal tissues were quantified by FQ-PCR. As a result, Northern blot showed that hERMAP was expressed in liver and bone marrow at 25+5 fetal age, but not in the other organ tissues. FQ-PCR results indicated that the hERMAP had been still expressed in 9-36th week fet

6、al liver, increased starting from 12th-week, reaching a peak between 18 -20th week and declining slowly starting from 21st-week. In the fetal bone marrow, expression of the hERMAP began from 15th week, reached a highest level between 27-32nd week and fell rapidly from 33rd week, the expression level

7、 of which was lower than that in liver. The low level expression of this gene was observed in some specimens of kidney, heart, lung, thymus, brain and skeletal muscle. It is concluded that the expression of hERMAP in fetal liver approximately consistent with haematopoiesis of fetal liver, and the ex

8、pression of this gene in bone marrow aged 15-32th fetal weeks coincides with haematopoiesis of fetal bone marrow. It suggests that the function of the hERMAP is possibly related with the migration of erythroid cells to liver and bone marrow during the fetal development process.Key words human ERMAP；

9、fetal stage；haematopoiesis近年來，Ye等1-3分別從鼠胚胎紅細(xì)胞和人胎肝cDNA文庫中篩選出編碼紅細(xì)胞膜相關(guān)蛋白（erythroid membrane-associated protein，ERMAP）基因，并證實(shí)其高度特異表達(dá)于胎肝、成人骨髓等造血組織以及K562和HEL細(xì)胞系，其編碼的蛋白分子定位于網(wǎng)織紅細(xì)胞和原始紅細(xì)胞膜、293T細(xì)胞膜和其他胞漿小體上，分析顯示其為一跨膜蛋白分子，屬免疫球蛋白超家族成員。推測ERMAP可能通過細(xì)胞間的黏附和（或）識(shí)別，影響紅系造血，或在紅系相關(guān)性疾病、 自身免疫性疾病和其他疾病中起一定作用。 目前關(guān)于該基因的特性與功能尚待進(jìn)一步

10、研究。本研究旨在通過觀察人類ERMAP基因在不同胎齡胎兒各臟器組織中的表達(dá)譜及表達(dá)量的變化，探討該基因在胎兒造血過程中的作用。材料和方法材料收集2004年3月至2004年11月由廣東省婦幼保健院、廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院、東山區(qū)婦幼保健院、海珠區(qū)婦幼保健院等醫(yī)院婦產(chǎn)科提供的難免流產(chǎn)胎兒，胎齡不限。均排除胎兒先天畸形、孕母遺傳性疾病、妊娠期間用藥史。胎兒離開母體后立即取肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺臟、胸腺、大腦、骨髓和肌肉9種臟器組織，放入凍存管，置于-80冰箱保存。方法總RNA的提取稱取50-100 mg組織置于研缽中，加入液氮研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至含1 ml RNA-solv的離心管中，按照RNA

11、-sol試劑（Omega公司產(chǎn)品）說明書提取RNA，置于-80保存。用紫外透射燈(Amersham公司產(chǎn)品)分析其純度，要求OD260/OD280值在1.8-2.0。提取物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)為完整RNA。ERMAP基因表達(dá)譜的Northern blot觀察選取1個(gè)胎齡為25+5周(25周過5天）的胎兒，將上述9種臟器組織的總RNA在1%瓊脂糖凝膠上甲醛變性電泳3小時(shí)（5 V/cm），在紫外分光光度儀下測量18S、28S條帶到點(diǎn)樣孔的距離，利用真空轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)膜2小時(shí)。然后以PCR方法分別標(biāo)記ERMAP和-actin探針（按照PCR DIG Probe Synthesis Kit試劑盒說明書操

12、作，引物由北京賽白盛有限公司合成），ERMAP引物序列為5-GAGATGGCGAGTTC TGCT-3 ，5-CACCGTCCTCCCCTTATA-3 ，-actin引物序列為5 -CATCTCTTGCTCGAAGTCCA -3，5 -ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3。對照管加入無DIG標(biāo)記的dNTPs。探針變性后進(jìn)行預(yù)雜交及雜交，經(jīng)過低嚴(yán)謹(jǐn)性和高嚴(yán)謹(jǐn)性洗膜后，加入Anti-Digoxigenin-AP孵育30分鐘，再加入CDP-Star顯色劑于尼龍膜上，將膜曝露在化學(xué)發(fā)光成像儀（美國System-genome公司產(chǎn)品）中檢測熒光信號(hào)。 ERMAP基因表達(dá)量的FQ-PCR檢測5

13、取各臟器組織的總RNA逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA（反應(yīng)體系參照Promega公司試劑說明）。將已測定濃度的含有ERMAP基因cDNA序列的pBluescriptSK+質(zhì)粒（加拿大McMaster大學(xué)病理與分子醫(yī)學(xué)系Dr. David Chui教授贈(zèng)送）依次10倍稀釋成7個(gè)濃度級梯度作為模板，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。取同一樣品的等量cDNA作為PCR模板，分別加入ERMAP及-actin的引物、探針以及TaqMan Universal PCR MasterMix（美國ABI公司產(chǎn)品），檢測ERMAP及-actin的表達(dá)水平，兩者之比即為ERMAP在各組織中的相對表達(dá)量。ERMAP和-actin引物與 MGB探

14、針由上海基康有限公司合成，序列如下：ERMAP primer1：5-CATGTGACGGAGGTGG ACAA-3 ERMAP primer2：5 -CAGCTTTATGGAGTTT TCCTTTTTCT-3 ERMAP MGB probe：FAM-CTTCTTTCAGACC ATGCTA-MGB-actin primer1：5-ACGGCCAGGTCATCAC CAT-3 -actin primer2：5-AAGGCTGGAAGAGTGCC TCAG-3。-actin MGB probe：FAM-CAATGAGCGGTTC CG-MGB。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理基因的相對表達(dá)量以±SD表示，采用

15、Origin Pro 7.5軟件進(jìn)行資料分析和繪圖。結(jié)果人類ERMAP基因在胎兒臟器組織中的表達(dá)譜Northern blot顯示肝臟和骨髓表達(dá)陽性，而脾臟、腎臟、胸腺、心臟、肺臟、大腦及肌肉等表達(dá)陰性（圖1）。胎肝組織RNA以ERMAP探針雜交后，其陽性條帶到點(diǎn)樣孔距離為4.04 cm，推算出目的基因的mRNA長度為3.6 kb，與人類ERMAP mRNA長度一致。人類ERMAP基因在不同胎齡胎兒組織中表達(dá)量的變化FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線將已測定濃度的含有ERMAP基因cDNA的質(zhì)粒pBluescriptSK+依次10倍稀釋成108-102 cps/l等7個(gè)濃度梯度，經(jīng)FQ-PCR后獲得典型的倒“

16、S”型曲線，可檢測到熒光信號(hào)的起始循環(huán)數(shù)（Ct）與模板濃度對數(shù)值的相關(guān)函數(shù)為=3.557Ct+38.152，r2=0.998178。人類ERMAP基因在胎兒肝臟和骨髓中的表達(dá)量ERMAP基因在9-36周胎兒肝臟中均有表達(dá)，其表達(dá)量從第12周開始升高，18-20周達(dá)高峰，21周后逐漸下降。ERMAP基因在胎兒骨髓中的表達(dá)則從15周開始，27-32周達(dá)高峰，之后迅速下降，各階段的表達(dá)量均低于肝臟（附表，圖2）。Table. Expression of ERMAP in fetal liver and bone marrow at different fetal ages（略）人類ERMAP基因在胎

17、兒其它臟器中的表達(dá)量檢測脾臟、腎臟、心臟、肺臟、胸腺、大腦及肌肉7種臟器各17個(gè)標(biāo)本，結(jié)果顯示ERMAP基因僅在部分標(biāo)本中低水平表達(dá)，其表達(dá)的陽性率（即各臟器陽性例數(shù)與總例數(shù)之比）分別為20%、7.6%、25%、13%、20%、7.6%和25%。討論人類胚胎期造血經(jīng)歷了卵黃囊造血、肝脾造血和骨髓造血等造血部位的遷移過程。卵黃囊造血始于妊娠第3周，終止于第8周。在妊娠第5周肝臟發(fā)育成完善的血竇系統(tǒng)，造血干細(xì)胞（hemotopoietic stem cells，HSC）隨血流遷移并種植于肝臟，進(jìn)入了胎肝造血期。隨著胚胎的不斷發(fā)育，胎肝來源的HSC不斷遷移至骨髓血管外基質(zhì)，在骨髓腔中分化成熟，形成骨

18、髓造血。骨髓造血一直持續(xù)至出生后，成為終身的造血器官。除了遷移至骨髓外，胎肝的HSC還可遷移、定植于脾臟、胸腺和淋巴結(jié)，并在其中開始造血活動(dòng)。在整個(gè)胚胎造血過程中，各器官的造血活動(dòng)是連續(xù)不斷、此消彼長的。但是期間的調(diào)控機(jī)理如何，至今尚未闡明。越來越多的研究表明，某一器官的造血能力主要取決于其造血微環(huán)境，當(dāng)一個(gè)器官的微環(huán)境不再適合造血活動(dòng)時(shí)，其中的造血干細(xì)胞便隨血液流向其它組織，與其中的成分相互作用，從而啟動(dòng)造血細(xì)胞的增殖與分化，最后形成新的造血中心4。造血細(xì)胞的遷移和定植是由造血細(xì)胞表面的一系列黏附分子與造血微環(huán)境中相應(yīng)的配體結(jié)合后所引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果6，這種黏附分子與相應(yīng)配體相互作用，在造

19、血細(xì)胞增殖和分化過程中同樣發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。造血微環(huán)境中的黏附分子及其配體，與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等共同形成造血調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分子基礎(chǔ)。紅系造血細(xì)胞發(fā)育過程的不同階段，其細(xì)胞膜表面的黏附分子的表達(dá)呈現(xiàn)一定的時(shí)空規(guī)律7。hERMAP基因編碼紅細(xì)胞跨膜蛋白，為一黏附分子，屬免疫球蛋白超家族成員。Xu等3證實(shí)，hERMAP基因表達(dá)于第12周和23周的胎肝紅細(xì)胞、成人骨髓，以及第8-12周臍帶血中的網(wǎng)織紅細(xì)胞和原始紅細(xì)胞，提示該基因在胚胎紅系造血中可能起到一定的作用。但Xu的研究僅為定性研究，且未對該基因在胚胎臟器中的表達(dá)量作連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察。本研究在本課題組建立的hERMAP基因FQ-PCR檢

20、測方法的基礎(chǔ)上5，對hERMAP基因在不同胎齡器官組織中的表達(dá)量進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。結(jié)果顯示，該基因在妊娠9-36周胎兒肝臟中均有表達(dá)，其表達(dá)規(guī)律與胎兒肝臟造血過程基本一致。該基因在胎兒骨髓中的表達(dá)則始于15周，30-32周達(dá)高峰，這與胎兒期骨髓造血活動(dòng)基本吻合，但妊娠32周后骨髓造血活動(dòng)仍然存，而hERMAP基因的表達(dá)卻迅速下降。由附表和圖2可見，在妊娠15-17周，hERMAP在胎肝的表達(dá)量出現(xiàn)較為明顯的下降，我們認(rèn)為這可能與粒系細(xì)胞的生成有關(guān)。早期胎肝所產(chǎn)生的幾乎全部是幼稚紅細(xì)胞，妊娠3-4個(gè)月胎兒紅細(xì)胞約為109/L，妊娠4個(gè)月左右胎肝開始有明顯的粒細(xì)胞生成。而在此階段，胎肝所生成的紅細(xì)胞數(shù)

21、量并無明顯的增加。由于本研究的檢測結(jié)果是以hERMAP與-actin的表達(dá)量之比表示的，反映的是hERMAP在各組織中的相對表達(dá)量。因此，在妊娠15-17周，hERMAP在胎肝的相對表達(dá)量下降，之后胎肝造血進(jìn)入旺盛階段，紅系造血明顯活躍，紅細(xì)胞數(shù)量可達(dá)1011/L，hERMAP的表達(dá)量出現(xiàn)高峰，直到21周后隨著肝臟造血活動(dòng)減弱而逐漸下降8。由上述結(jié)果推測，人類ERMAP基因的功能可能與胎兒發(fā)育過程中紅系細(xì)胞向肝臟和骨髓的遷移活動(dòng)有關(guān)，在肝臟造血后期以及妊娠后期，大量造血細(xì)胞向肝臟和骨髓的遷移活動(dòng)基本完成，其基質(zhì)內(nèi)的ERMAP配體數(shù)量下降，ERMAP基因的表達(dá)水平也隨之下降；但ERMAP蛋白與其

22、配體作用的機(jī)制如何，其是否參與了胚胎紅系造血細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控，仍有待下進(jìn)一步的研究證實(shí)。研究結(jié)果還顯示，該基因在胎兒脾臟、腎臟、心臟、肺臟、胸腺、大腦及肌肉等臟器組織中的表達(dá)水平較低或不恒定。取胎齡25+5周的胎兒臟器進(jìn)行Northern blot檢測也同樣證實(shí)了該基因主要表達(dá)于胎肝及骨髓組織，而在其它臟器組織中表達(dá)陰性，推測可能與下列因素有關(guān)：在胚胎造血過程中，雖然卵黃囊、胎肝或骨髓的HSC可遷移、定植于脾臟、胸腺，但其產(chǎn)生的造血細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)不如胎肝和骨髓9，所以ERMAP基因的表達(dá)量較低；腎臟、心臟、肺臟、大腦及肌肉不是造血器官，缺乏ERMAP的特異性配體，但由于胎兒血液中含有一定數(shù)量的

23、HSC，在這些器官或組織中亦可以檢測到ERMAP的低水平表達(dá)，但并不恒定。遺憾的是，由于取材條件所限，本研究未能觀察到hERMAP在妊娠9周以前以及36周以后的表達(dá)情況，因此未能對胚胎發(fā)育全過程的ERMAP基因表達(dá)規(guī)律作更全面的動(dòng)態(tài)研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Ye TZ，Gordon CT，Lai YH，et al. Ermap, a gene coding for a novel erythroid specific adhesion / receptor membrane protein. Gene, 2000; 242: 337-3452 Su YY，Gordon CT，Ye TZ，et al. Human ERMAP: an erythroid adhesion / receptor transmembrane protein. Blood Cells Mol Dis, 2001; 27:938-9493 Xu H，F(xiàn)oltz L，Sha Y，et al. Cloning an