半枝蓮提取物誘導人肝癌SMMC7721細胞凋亡及其對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

1、半枝蓮提取物誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡及其對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 作者：韋鵬涯 浦洪琴 韋星 賓曉蕓 李朝敢【摘要】 目的探討半枝蓮提取物(Scutellaria barbata D. Don extract, SBE)對人肝癌SMMC-7721細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，Survivin和Caspase-3表達的影響。方法體外培養(yǎng)SMMC-7721細胞，以2.5，5和10 mg·L-1SBE處理48 h，并以2.5 mg·L-1順鉑（DDP）作為陽性對照。用MTT法檢測細胞抑制率，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，二步法免疫組化檢測Bcl-2，Survivin和

2、Caspase-3蛋白表達。結(jié)果 與正常對照組相比，SBE各濃度組細胞抑制率顯著升高（P0.001），細胞凋亡率明顯上升（P0.01），Caspase-3蛋白表達顯著上升（P<0.01或P<0.05），Bcl-2和Survivin蛋白表達明顯下降（P<0.01或P<0.05）。結(jié)論 SBE具有誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡的作用，其分子機制可能與上調(diào)Caspase-3蛋白表達以及下調(diào)Bcl-2和Survivin蛋白表達有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 半枝蓮 SMMC-7721細胞 細胞凋亡 Bcl-2; Survivin Caspase-3Abs

3、tract：ObjectiveTo explore the apoptosis-inducing effect of Scutellaria barbata D. Don extract（SBE）and the expression of apoptosis associated proteins Bcl-2, Survivin and Caspase-3 on human liver cancer SMMC-7721 cells. MethodsSMMC-7721 cells were treated with 2.5, 5 and 10 mg·L-1 SBE for 48h, a

4、nd the cells were treated with 2.5mg·L-1 DDP as positive control. The inhibitory rat was evaluated by MTT assay. The apoptotic rate was determined by flow cytometry. The expression of Bcl-2, Survivin and Caspase-3 proteins were detected by two-step immunohistochemical staining.ResultsCompared w

5、ith control group, the inhibitory rate was increased obviously(P<0.001), the apoptotic rate was increased markedly(P<0.01), the expression of Caspase-3 protein was increased significantly(P<0.01 or P<0.05), while Bcl-2 and Survivin proteins were decreased markedly (P&

6、lt;0.01 or P<0.05) in SBE groups. ConclusionSBE can induce apoptosis of liver cancer SMMC-7721 cells. The molecular mechanism might be related to up-regulating the expression of Caspase-3 and down-regulating the expression of Bcl-2 and Survivin apoptosis related proteins.Key words：Scutellaria

7、 barbata D. Don; SMMC-7721 cells; Apoptosis半枝蓮Scutellaria barbata D. Don，SB屬于唇形科植物，臨床上常用于肝癌、肺癌、胃癌和鼻咽癌等多種癌癥防治，但具體的抗癌機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，半枝蓮提取物（SBE）能誘導白血病K562細胞凋亡，其作用機制可能與Caspase3的表達升高和活化有關(guān)1；SBE可誘導人肝癌QGY-7701細胞凋亡，并能上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2的表達2；SBE還通過上調(diào)凋亡相關(guān)基因蛋白Fas表達，促進人肝癌Hep-G2細胞凋亡3。本研究觀察了SBE誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡作用，并檢測凋亡相關(guān)蛋

8、白Bcl-2，Survivin 和Caspase-3表達情況，以探討SB抗肝癌作用及其初步分子機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。1 器材與方法1.1 材料1.1.1 細胞人肝癌細胞株SMMC-7721由中科院上海細胞生物研究所細胞庫提供。1.1.2 試劑與儀器胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，碘化丙啶(PI)為Sigma公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑藍（MTT）為上海普飛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，鼠抗Bcl-2、Survivin和Caspase-3單克隆抗體為Santa cruz公司產(chǎn)品，PowerVisionTM免疫組化檢測試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品。wellsca

9、n K3 酶標儀(芬蘭)，BX51型顯微鏡（OLYMPUS），F(xiàn)acscallbar型流式細胞儀（USA）。1.2 方法1.2.1 藥物提取按文獻4方法，取SB(購于廣西壯族自治區(qū)百色市中醫(yī)醫(yī)院中藥房)干品粗粉50 g，用75%乙醇浸泡3 h，共浸泡3次，溫度40，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥得SB浸膏，二甲基亞楓（DMSO）溶解浸膏樣品配制成濃度為10mg·ml-1提取物藥液, 再以細胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度供實驗用。1.2.2 細胞培養(yǎng)和藥物處理肝癌SMMC-7721細胞，以含100 U·ml-1青霉素，100 g·ml-1鏈霉素、10% FBS的RPMI 1640

10、培養(yǎng)液，在37，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長至對數(shù)增殖期，更換含0，2.5，5，10 mg·L-1SBE新鮮培養(yǎng)液，用DDP(2.5 mg·L-1)為陽性對照組，藥物作用時間均為48 h。1.2.3 細胞抑制實驗(MTT法)將對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞移入96孔培養(yǎng)板中，細胞密度約為1×104個/ ml，每孔加入200 l細胞懸液，培養(yǎng)24 h。吸棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液，加入含SBE的10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液200 l，每個藥物濃度設(shè)4個平行復孔，另設(shè)DDP為陽性對照組和空白對照孔。培養(yǎng)到44 h，每孔加入MTT（5 mg·ml-1）

11、20 l，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 150 l，用震蕩混合儀震蕩10 min。選擇492 nm波長酶標儀測定每孔光吸收值（OD值）。實驗重復3次。按下公式計算抑制率：抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡藥物作用后，收集各組細胞約1×106個，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液；PBS沖洗2次，加入70%預冷的乙醇固定，4，124 h；離心棄去固定液，PBS沖洗去乙醇；PBS重懸細胞，400目的篩網(wǎng)過濾1次，離心棄去PBS；加入RNase A(終濃度為60 g

12、3;ml-1)，搖勻，37溫育30 min，加入PI(終濃度為50 g·ml-1)，4避光30 min；每份標本測定(24)×103個細胞，流式細胞儀檢測，用MoufitLT軟件分析結(jié)果。1.2.5 免疫組化法檢測基因蛋白表達按照二步法免疫組化檢測試劑盒說明書操作：藥物處理細胞后，收集細胞，PBS沖洗兩次；制成細胞懸液涂片，風干后丙酮固定15 min；3%過氧化氫孵育5 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；滴加一抗（稀釋1100），室溫90 min，PBS沖洗，2 min×3次；滴加IgG抗體-HRP多聚體20-30 min，PBS沖洗，5 min×3次；用

13、DAB溶液顯色；蒸餾水沖洗、蘇木素襯染、脫水、封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果分析：Bcl-2蛋白定位于胞膜或胞漿，Survivin和Caspase-3蛋白定位于胞漿，細胞膜或細胞漿染為棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞。利用CMLAS彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行分析，隨機計數(shù)低倍鏡下6個視野中的陽性細胞數(shù)和總細胞總數(shù)，求出每組細胞的陽性率。1.2.6 統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，參數(shù)統(tǒng)計采用t檢驗。2 結(jié)果2.1 各組SMMC-7721細胞抑制率的比較細胞抑制實驗結(jié)果顯示（表1）， SBE各濃度組的細胞抑制率均顯著高于正常對照組（P&

14、;lt;0.001）。表1 各組SMMC-7721細胞抑制率的比較（略）2.2 各組SMMC-7721細胞凋亡比較在DNA直方圖上（圖1），SBE各濃度組和DDP組G1峰前均出現(xiàn)凋亡細胞所特有的亞二倍體峰（sub-G1），即細胞凋亡峰；正常對照組，2.5，5，10 mg/L-1 SBE組和DDP組的細胞凋亡率分別為(1.57±0.68)%，（8.06±1.02）%，（15.45±0.90）%，（24.03±2.23）%和（19.46±1.14）%，SBE各濃度組細胞凋亡率均顯著高于正常對照組（P0.01，n=6）。2.3 各組SMMC-7721

15、細胞基因蛋白表達比較與正常對照組比較，SBE各濃度組細胞Bcl-2和Survivin蛋白表達明顯下降（P0.01或P0.05），Caspase-3蛋白表達明顯上升（P0.01或P0.05）。見表2。表2 各組細胞Bcl-2、Survivin和Capase-3蛋白表達比較(略)3 討論本實驗觀察到SBE對SMMC-7721細胞具有明顯的抑制增殖和誘導癌細胞凋亡的作用，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。SB含有黃酮類化合物、生物堿、甾類、鞣質(zhì)等，而SB乙醇提取物主要是黃酮類化合物5。研究發(fā)現(xiàn)，植物的某些成分如黃酮類和生物堿等化合物具有明顯的抗腫瘤作用，并且這種作用的機制之一是誘導細胞凋亡6。由此推測，本實驗

16、誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡的SB活性成分主要是黃酮類化合物，但其確切的抗癌活性成分尚待進一步研究。Caspase-家族是Fas/Apo-1介導的凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑的關(guān)鍵效應(yīng)分子，又是多種凋亡途徑共同作用的因子，其蛋白表達水平的高低決定著細胞凋亡程度7。本實驗結(jié)果顯示，Caspase-3蛋白表達隨著SBE濃度增高而升高，提示SBE可以通過影響Caspase-3蛋白水平的表達，激活細胞凋亡程序，進而誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡。 Bcl-2蛋白的功能是阻遏細胞凋亡，多種化療藥物及中藥的抗腫瘤活性均與Bcl-2基因表達下調(diào)有關(guān)8。生存素（Survivin）是最近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(inh

17、ibitors of apoptosis protein, IAP)，是迄今發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子9。Survivin抗凋亡作用已被研究證實，它不僅通過阻斷線粒體細胞色素C釋放，與下游凋亡效應(yīng)因子Caspase-3和Caspase-7結(jié)合而對其活性產(chǎn)生直接抑制效應(yīng)，而且還通過與紡綞體纖維的結(jié)合，間接抑制Caspase對紡綞體的水解作用，有利于保護有絲分裂細胞的完整性，從而抑制細胞凋亡10。另外，Survivin與細胞周期素依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)形成Survivin- CDK4復合體，釋放出P21，而P21能進一步與線粒體Caspase-3

18、結(jié)合，抑制其活性，阻止細胞凋亡11。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，SBE各濃度組Bcl-2和Survivin蛋白表達明顯下降，提示SBE誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡機制可能與下調(diào)Bcl-2和Survivin蛋白表達有關(guān)。 在SBE誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡分子機制中，Caspase-3，Bcl-2和Survivin之間關(guān)系如何，其他基因是否參與，尚待深入研究。我們相信SB作為一種傳統(tǒng)的抗腫瘤中草藥，隨著其抗腫瘤活性成分及機制的進一步明確，在腫瘤的預防和治療中必將展現(xiàn)其廣闊的應(yīng)用前景?！緟⒖嘉墨I】 1謝珞琨，鄧 濤，張秋萍，等. 半枝蓮提取物誘導白血病K562細胞凋亡J.武漢大

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