新型表達骨形態(tài)發(fā)生蛋白2腺病毒真核細胞載體的構(gòu)建和鑒定

1、新型表達骨形態(tài)發(fā)生蛋白2腺病毒真核細胞載體的構(gòu)建和鑒定 作者：張正，劉丹平，陳峻江，郭韜，張男【摘要】 目的 構(gòu)建同時表達具有抗原表位FLAG標記的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)目的蛋白和報告分子綠色熒光蛋白(GFP)的新型腺病毒真核細胞表達載體。方法 將去除翻譯終止密碼子并添加新的酶切識別位點Xho的BMP2基因定向連入腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1。攜帶BMP2+基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定、Pme酶切線性化后轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1大腸桿菌，利用細菌內(nèi)同源重組機制將BMP2+和GFP基因連同其順勢表達元件重組入腺病毒基因組質(zhì)粒。用Pac酶切去除其質(zhì)

2、粒成分，暴露腺病毒基因組的反向末端重復(fù)序列，轉(zhuǎn)染293細胞，進行腺病毒的包裝，完成新型腺病毒載體Ad CMV-BMP2+-IRES-GFP-1的構(gòu)建。作為陽性對照，同時制備多年來廣為應(yīng)用的 BMP2腺病毒表達載體Ad CMV-BMP2。以兩種載體感染骨髓基質(zhì)細胞，通過RT-PCR和熒光顯微鏡分別檢測骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和綠色熒光蛋白表達情況;通過堿性磷酸酶活性檢測判斷BMP2誘導成骨分化作用 。結(jié)果 突變后骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因序列、重組腺病毒穿梭質(zhì)粒和重組腺病毒質(zhì)粒酶切圖譜符合預(yù)定設(shè)計。感染骨髓基質(zhì)細胞后，新型腺病毒載體可同時表達報告分子GFP和具有誘導成骨分化活性的BMP2。結(jié)論 成功構(gòu)建表達B

3、MP2的新型腺病毒載體。 【關(guān)鍵詞】 骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因;綠色熒光蛋白;腺病毒載體;同源重組;成骨誘導 Abstract: Objective To construct a novel recombinant adenovirus vector expressing the BMP2 fused to FLAG epitope and green fluorescent protein(GFP) as a reporter on the same transcript. Methods The basic pairs of BMP2 behind the translation stoppi

4、ng codon TAG were removed and a Xhorestriction site was added following the end of the mutant. Then, the mutant of BMP2 gene (BMP2+ gene)was ligated into the multiple cloning sites of the adenovirus shuttle plasmid pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1 by means of the directional cloning technology. Once tested

5、 by restriction digestion, the shuttle plasmid was linearized with Pme I and transformed into BJ5183-AD-1 cells to recombine the genes of BMP2+ and GFP together with their cis-acting elements into adenoviral plasmid through a new simplified bacterial homologous recombinant method. To expose its inve

6、rsted terminal repeats, the recombinant adenoviral plasmids were digested with Pac, and were then used to 293 transfected cells to generate the desired recombinant adenoviruses, Ad CMV-BMP2+-IRES-GFP-1. After the resultant viruses infected the bone marrow stromal cells (MSCs), the expression of BMP-

7、2 gene was verified by RT-PCR, the osteoinduction activity of the expressed BMP2 was confirmed by alkaline phosphatase activity assay, and the expression of GFP gene was tested through fluorescence microscope. As a positive contrast, another recombinant adenovirus, AdCMV-BMP2, which has been used ex

8、tensively since many years ago, was also constructed.Results Either the sequence of BMP2 gene mutant or the restriction maps of the recombinant adenoviral shuttle plasmids and the recombinant adenoviral plasmids accorded with experimental project beforehand. The new recombinant adenovirus vectors co

9、uld express both the gene of BMP2 and GFP at the same time. The expressed BMP2 had osteoinduction activity. Conclusions A novel recombinant adenovirus vector expressing the BMP2 fused to FLAG epitope and green fluorescent protein as a reporter on the same transcript were successfully constructed.Key

10、 words: bone morphogenetic protein 2 (BMP2) gene; green fluorescent protein (GFP); adenovirus vector; homologous recombination; osteoinduction重組腺病毒在基因治療中被作為一種高效基因轉(zhuǎn)移和表達載體，廣泛用于將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎?。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2 ,BMP-2)是一種重要的成骨誘導分化細胞因子，可誘導具有成骨分化潛能的間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化，在骨的發(fā)生、發(fā)育、修復(fù)和再生過程中發(fā)揮十分關(guān)鍵的

11、作用。BMP-2轉(zhuǎn)基因誘導成骨可實現(xiàn)一定時間內(nèi)的BMP-2持續(xù)表達，近十年來受到廣泛關(guān)注。迄今為止，病毒型和非病毒型BMP-2表達載體都已被用于BMP-2基因轉(zhuǎn)移誘導成骨研究，其中BMP-2腺病毒表達載體(BMP2-expressing recombinant adenoviral vector,Adv-BMP2)介導的BMP-2轉(zhuǎn)基因方法被認為是其中最有效的手段2。為了方便基因的表達檢測，我們利用了一種新型的腺病毒載體構(gòu)建系統(tǒng)，使BMP2基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因同時表達，并且通過對BMP2基因的突變，將FLAG抗原標記附加于BMP2，構(gòu)建了一種新型的BMP2腺病毒表達載體。1 材料和

12、方法1.1 主要試劑限制性內(nèi)切酶:Not、Xba、Xho;高保真DNA聚合酶(TaKaRa PyrobestTMDNA Polymerase);大腸桿菌來源的堿性磷酸酶(Bacterial Alkaline phosphatases ,BAP);dNTP;T4DNA連接酶(T4DNA Ligase);DNA凝膠回收試劑盒;RT-PCR試劑盒和DNA Marker：DL1500、DL2000、Handdigest等購于寶生物工程(大連)有限公司。限制性內(nèi)切酶Pme、Pac I購于紐英倫(北京)生物技術(shù)有限公司。PCR提純試劑盒(PCR Purification Kit)， 磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒(MB

13、S Mammalian Transfection Kit)為美國Stratagene公司產(chǎn)品。超純質(zhì)粒提純試劑盒(MobiusTM 1000 Plasmid Kit )為德國Novagene公司產(chǎn)品。ALP檢測試劑盒(Alkaline/Acid Phosphatase Assay Kit)購于美國upstate公司。1.2 質(zhì)粒和菌株pcDNA3-BMP2由第四軍醫(yī)大學生化教研室蒲勤教授提供，BMP2基因cDNA位于多克隆位點Not、Xho位點之間，后者在基因連入過程中已經(jīng)被破壞。pcDNA3-BMP2+(BMP2+代表攜帶去除翻譯終止密碼子并添加新的酶切識別位點Xho的BMP2基因)、腺病毒

14、穿梭質(zhì)粒pShuttle CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1及pShuttle CMV- BMP2均由我們自己構(gòu)建和保存3。BJ5183-AD-1大腸桿菌為Stratagene公司產(chǎn)品。1.3 細胞及細胞系人胚腎293細胞系為American Type Culture Collection( ATCC)產(chǎn)品。骨髓基質(zhì)細胞由本院外科實驗室培養(yǎng)、保存。1.4 細菌內(nèi)同源重組構(gòu)建腺病毒質(zhì)粒將含有pShuttle CMV-BMP2+-IRES-hrGFP-1質(zhì)粒和pShuttle CMV-BMP2質(zhì)粒的菌株分別化線接種于LB-Kanamycin Agar,37 倒置培養(yǎng)過夜;次日挑選單克隆

15、,分別接種于10 mL LB-Kanamycin Broth，37 、劇烈振蕩、過夜培養(yǎng);第二日上午用堿裂解法抽提質(zhì)粒抽提質(zhì)粒， Pme 酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，確保穿梭質(zhì)粒已經(jīng)被Pme 酶切線性化。乙醇精制以上酶切反應(yīng)體系，重新溶解于ddH2O中，使終濃度為50100 ng /L，備用。電穿孔儀設(shè)置在200 , 2.5 KV, 25 F條件下。冰上預(yù)冷0.2 cm gap電擊杯、電擊池和2只微量離心管。冰上解凍BJ5183-AD-1電感受態(tài)細胞。于2只微量離心管中各加入40 L電感受態(tài)細胞胞，分別加入1 L Pme 酶切線性化的pShuttle CMV-BMP2+-IRES-hrGFP

16、-1和pShuttle CMV-BMP2,混合均勻后加入2支0.2 cm gap電擊杯。將電擊杯置于電擊池內(nèi)，送入電穿孔儀分別電擊。電擊后迅速向每只電擊杯中加入500 L的LB-Broth，吸打混均，接種于LB-Kanamycin Agar,37 倒置培養(yǎng)過夜。次日挑選10個單克隆，分別接種于10 mL LB-Kanamycin Broth，37 、劇烈振蕩、過夜培養(yǎng)。取5 mL過夜培養(yǎng)物抽提質(zhì)粒， Pac 酶切，在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定，篩選重組成功的陽性克隆。剩余的4mL置于4 冰箱保存。將保存的4 mL陽性細菌克隆液體培養(yǎng)物接種于250 mL LB-Kanamycin Broth，

17、大量擴增、用超純質(zhì)粒提純試劑盒抽提pAd CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1和 pAd CMV-BMP2。1.5 腺病毒載體包裝Pac酶切pAd CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1和 pAd CMV-BMP20.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證，確保酶切完全后，以PCR反應(yīng)提純試劑盒精致酶切反應(yīng)液，以去除酶和緩沖液，并將DNA(腺病毒基因組)重溶于滅菌ddH2O ，使終濃度為5 g/225 L ，-20保存?zhèn)溆谩３Ｒ?guī)復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)293細胞，轉(zhuǎn)染前24 h在2支直徑6 cm培養(yǎng)皿內(nèi)分別植入(78) × 105細胞，加 4 mL含10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ，5

18、% CO2 條件下過夜培養(yǎng)至70%匯合。以5 g DNA/只培養(yǎng)皿比例，將上述制備的兩種腺病毒基因組DNA及轉(zhuǎn)染試劑按照商家說明分別加入細胞培養(yǎng)皿中，37 ，5% CO2溫育10 h，用磷酸鈣法將腺病毒基因組DNA轉(zhuǎn)染于293細胞。繼續(xù)培養(yǎng)710日，必要時換液，待出現(xiàn)明顯細胞病變現(xiàn)象后收集細胞，反復(fù)凍-融三次裂解細胞，離心收集病毒并測定病毒滴度，完成腺病毒載體的包裝。1.6 BMP2和GFP表達檢測將MSC細胞以5×105/孔的密度接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h細胞貼壁后，吸棄上清。隨機選取2 孔感染腺病毒Ad-CMV - BMP2+-IRES-hrGFP-1 ，另取2 孔感染Ad

19、CMV-BMP2作為陽性對照，感染復(fù)數(shù)(MOI)均為50，留下2孔作為陰性對照。37 孵育1 h，換成DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)基，在體積分數(shù)為5%CO2、37 飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)72 h,熒光顯微鏡下檢測GFP,然后按商家產(chǎn)品說明,用RNA提純試劑盒抽提細胞總mRNA。置于-80 冰箱保存待用。取3 種RNA 各約80 ng加入3 支反應(yīng)管內(nèi)，以8.5 L去RNA酶ddH2O稀釋，75 變性5 min，冰上冷卻。按商家說明建立反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)錄BMP2基因cDNA第一鏈。反應(yīng)結(jié)束后冰上冷卻5 min備用。設(shè)計合成BMP2基因cDNA特異引物： 5-CGTGACTCTGTCTTCTAG-3

20、 ;5/-GCACACTCGAGGCGACAC-3。PCR擴增BMP2 cDNA，取10 L在以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。BMP2基因在三組細胞內(nèi)的mRNA 表達情況。1.7 堿性磷酸酶活性檢測將第二代MSC細胞以1×103/孔的密度接種于96 孔板，在完全培養(yǎng)基內(nèi)， 5%CO2、37 、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。隨機選取32孔作為實驗組(感染腺病毒Ad-CMV - BMP2+-IRES-hrGFP-1， MOI=50);另選32孔作為陽性對照組(感染Ad CMV-BMP2， MOI=50);其余32孔作為陰性對照組(不予感染腺病毒載體)。37 孵育1 h，小心吸除個孔內(nèi)的液體，用P

21、BS清洗實驗組和陽性對照組各孔兩次，然后用完全培養(yǎng)基繼續(xù)在5%CO2、37、飽和濕度條件下培養(yǎng)各組細胞。分別于感染載體后第6、8、10、12日收集各組細胞，每次各組均收集8孔，調(diào)整各孔細胞濃度為1×105cells/mL,各取1 mL用于ALP活性檢測。繪制ALP活性曲線;對三組細胞6、8、10、12日4個時間點的ALP活性采用發(fā)樣本均數(shù)兩兩比較q檢驗，進行統(tǒng)計學分析，以P<0.05的差異具有顯著性。1.8 采用重復(fù)測量的方差分析。2 結(jié) 果2.1 腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 見圖1、2。2.2 ALP活性檢測結(jié)果 見表1。表1 不同時間3 組細胞間ALP活性比較注：三組比較F值

22、=4.32，P<0.05;q1.3=4.67，P<0.01;q2.3=4.64，P<0.01;q1.2=0.47，P>0.053 討 論3.1 新型BMP2腺病毒載體的構(gòu)建細菌內(nèi)同源重組法是一種高效構(gòu)建腺病毒載體的方法4，這種方法首先需要構(gòu)建帶有目的基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒，然后將其與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)BJ5183大腸桿菌，通過細菌內(nèi)同源重組機制將目的基因及其在真核細胞中表達所必需的順勢表達元件插入腺病毒基因組。pShuttle CMV -IRES-hrGFP-1是美國Stratagene公司開發(fā)的一種新型腺病毒穿梭質(zhì)粒，具有CMV啟動子、多

23、克隆位點和PolyA信號區(qū)等真核基因表達所必需的順勢調(diào)控元件和同源重組序列。并且在多克隆位點后依次設(shè)計安排了FLAG抗原表位(FLAG epitope, FLAG為人工合成抗原表位，其氨基酸殘基序列為DYKDDDDK)基因、內(nèi)部核糖體進入位點(internal ribosome entry site ,IRES)和GFP基因。由于IRES的存在，使插入多克隆位點的目的基因能與GFP基因以雙順反子的形式同時表達。雙基因表達載體是載體構(gòu)建新的發(fā)展方向，以雙順反子形式表達GFP報告基因和BMP2目的基因，同時能夠?qū)MP2進行抗原表位標記的腺病毒表達載體可極大的方便BMP2蛋白表達檢測，目前尚未見報

24、道，是一種新的嘗試。實驗通過PCR技術(shù)突變?nèi)コ齪cDNA3-BMP2所攜帶的BMP2基因序列中翻譯終止密碼子后的堿基序列，在其后添加Xho位點。添加Xho位點后使基因能夠定向連接于pShuttle CMV -IRES-hrGFP-1多克隆位點中的Not和Xho之間。去除翻譯終止密碼子之后堿基的BMP2基因序列從翻譯起始密碼子到FLAG抗原表位基因的堿基序列長度為1194bp，不會導致FLAG抗原表位基因的框移突變，而且由于去除了BMP2基因的終止密碼子，導致兩個基因的通讀，使兩種蛋白融合表達。重組腺病毒穿梭載體制備成功后，利用BJ5183細菌內(nèi)的同源重組機制，構(gòu)建了腺病毒質(zhì)粒Ad CMV-BM

25、P2+-IRES-rhGFP-1和Ad CMV-BMP2。Pac酶切圖譜表明在不同BJ5183重組陽性克隆內(nèi)，由于穿梭質(zhì)粒和腺病毒質(zhì)粒均存在DNA原核復(fù)制起點Ori序列，重組成功的腺病毒質(zhì)粒經(jīng)Pac酶切后應(yīng)該產(chǎn)生一個大于23kb的DNA 片段和約3.0kb或4.5kb的小片段兩種均可以接受的情況。在已經(jīng)鑒定的Ad CMV-BMP2+-IRES-rhGFP-1陽性克隆中，這兩種情況均已出現(xiàn)。而已鑒定的Ad CMV-BMP2陽性克隆， Pac酶切僅產(chǎn)生23kb和3.0kb兩種長度的DNA酶切片段(圖1、圖2)。實驗中采用了先進的細菌內(nèi)同源重組法來構(gòu)建腺病毒載體，從而大大節(jié)省了時間與費用。與目前普遍

26、采用的哺乳動物細胞內(nèi)同源重組法相比，這種方法具有簡便、快捷、經(jīng)濟和高效等優(yōu)勢。前者在293等包裝細胞內(nèi)進行同源重組，細胞的狀態(tài)對重組效率影響很大，通常要求傳代次數(shù)不得超過45代，因此有時不得不重復(fù)引進代數(shù)較低的293細胞;另外，293細胞既是同源重組的場所，又是病毒的包裝的場所，包裝后的病毒需要經(jīng)過反復(fù)的篩選、鑒定和純化5。后者是對細菌操作，其培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化和重組克隆的篩選遠較細胞方便、快捷和經(jīng)濟，技術(shù)也較成熟，從質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到重組克隆的出現(xiàn)僅需1220 h，加上篩選的時間也不過36 h;最重要的是，重組DNA(腺病毒質(zhì)粒)經(jīng)鑒定后在293細胞內(nèi)包裝，不需要再對病毒進行篩選和鑒定，病毒滴度和純度都較高

27、。3.2 新型BMP2腺病毒載體的表達分析為了檢測所構(gòu)建的新型載體表達GFP和BMP2情況，進一步將其和陽性對照載體分別轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細胞(MSCs)，同時用未轉(zhuǎn)染載體的MSCs作陰性對照。轉(zhuǎn)染3天后，首先在熒光顯微鏡下對活細胞進行觀測，結(jié)果顯示感染新型載體的細胞表達GFP(圖3)。然后分別收集裂解三種細胞，提取其RNA，設(shè)計合成BMP2基因特異的正、反向引物，進行RT-PCR檢測。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，從轉(zhuǎn)染兩種重組腺病毒載體的MSCs中，均擴增出長度一致的DNA片段，這一長度符合預(yù)期設(shè)計(兩引物間跨度為1190bp)，而陰性對照沒有擴增出任何DNA片段，從而在mRNA水平上證實了載體表達B

28、MP2基因的可行性(圖4)。為了進一步驗證載體表達產(chǎn)物(BMP2)的成骨誘導效應(yīng)和初步了解其時間動力學規(guī)律，實驗中對MSCs感染載體前后的ALP活性進行了檢驗，并選用感染后6、8、10、12日幾個時間點對其進行了連續(xù)觀測。ALP是成熟成骨細胞具有代表性的標志酶，具有水解有機磷酸物質(zhì)，提高局部磷酸根濃度和水解破壞鈣化抑制劑等重要功能，在體內(nèi)外鈣化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，ALP升高是MSCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化的靈敏指標6。感染后第6日檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學分析顯示，新型載體和陽性對照載體均可以顯著提高MSCs的ALP活性水平(P< 0.01)，兩種載體效應(yīng)差異無顯著統(tǒng)計學意義(P>0

29、.05)，因而在表達產(chǎn)物的生物學行為層次上也證明了新型載體表達BMP2基因的可行性(表1)。以連續(xù)觀測結(jié)果繪制的曲線圖(圖5)顯示，細胞感染載體后8日內(nèi)ALP活性升高幅度較大，說明載體表達BMP2量或其生物活性是十分高的，短期內(nèi)即可發(fā)揮明顯的生物學效應(yīng);10天后上升速度明顯減慢，曲線趨于平緩，ALP活性維持在一個較高水平，這可能與此時細胞生長、分化或BMP2作用已經(jīng)接近飽和有關(guān)，實驗中我們觀察到，此時細胞生長已經(jīng)鋪滿培養(yǎng)板各孔底部。從曲線圖中還可以看到，MSCs本身有一定的基礎(chǔ)表達，但水平較低，曲線基本上呈一條平滑的基線，這是因為實驗所應(yīng)用的MSCs是基于骨髓基質(zhì)干細胞的帖壁特點獲得的，并非單

30、一的細胞類型，其中包含有少量具有分泌ALP能力的細胞類型，如成骨細胞和確定性成骨祖細胞(DOPC)等。實驗所構(gòu)建的BMP2腺病毒表達載體與以往的BMP2腺病毒載體不同，它可以同時表達具有抗原表位標記的目的蛋白BMP2和報告分子GFP，這使新載體比原有載體具有很大的優(yōu)勢。首先，引入報告分子GFP使檢測活細胞BMP2表達成為可能。因此，一方面可以即時監(jiān)測表達情況;另一方面，細胞經(jīng)檢測后仍然可以用于后續(xù)實驗7。其次，引入FLAG抗原標記增加了對目的基因的檢測手段，這在缺乏目的基因特異性單克隆抗體的情況下尤為重要8?！緟⒖嘉墨I】 1 Romano G，Michell P，Pacilio C，et al. Latest developments in gene transfer technology: achievements, perspectives, and controversies over therapeutic applicationsJ.Stem Cells, 2000, 18(1):19-39.2 Alden TD, Varady P,et al. Bone morphogenetic protein gene therapyJ. Spine,2002 ,27(16 Suppl 1): 87-93.3 張正，劉丹平,等.腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle CMV-BMP2+