人骨髓間充質(zhì)干細胞分離鑒定方法的改進

1、人骨髓間充質(zhì)干細胞分離鑒定方法的改進         08-03-08 15:29:00     編輯：studa20       作者：吳潔瑩，廖燦，許遵鵬，陳勁松，辜少玲【摘要】  本研究的目的是建立一種基于臨床移植需要的分離、培養(yǎng)、鑒定人骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）的方法，為配合造血干細胞移植的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。采用Percoll分離液（1.073 g/

2、ml）從新鮮成人骨髓穿刺液中分離MSC，應(yīng)用貼壁篩選法傳代培養(yǎng)，流式細胞儀檢測細胞表面抗原，成骨誘導(dǎo)體系（地塞米松0.1 mol/L、-甘油磷酸鈉10 mmol/L、抗壞血酸磷酸鹽50 mol/L）及脂肪誘導(dǎo)體系（地塞米松1 mol/L、牛胰島素5 mg/L、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤0.5 mmol/L、消炎痛60 mol/L）分別誘導(dǎo)MSC定向分化，通過細胞形態(tài)觀察及免疫化學(xué)染色進行鑒定。 結(jié)果表明： 從成人骨髓液中分離培養(yǎng)出MSC，穩(wěn)定表達CD73、CD105、CD166，不表達CD34、CD45。定向誘導(dǎo)的成骨細胞表達堿性磷酸酶活性，脂肪細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂滴。結(jié)論：采用密度梯度離心聯(lián)

3、合貼壁篩選法并通過流式細胞術(shù)檢測及定向誘導(dǎo)分化，能夠從成人骨髓液中分離出MSC，并完成細胞表型及多向分化潛能的初步鑒定。本操作方案具有一定的臨床應(yīng)用價值。 【關(guān)鍵詞】  間充質(zhì)干細胞A modified Method to Isolate and Identify the  Adult Mesenchymal Stem Cells from Human Bone MarrowAbstract  The study was aimed to establish a protocol of isolating and culturing adult mesenchym

4、al stem cells (MSC) from human bone marrow aspirate and identify them by surface antigen analysis and committed differentiation in order to provide an experimental foundation for achieving a therapeutic benefit in applying MSC in hematopoietic stem cell transplantation.  MSCs were obtained from

5、 fresh human bone marrow aspirate by gradient centrifugation with Percoll (1.073 g/ml) and anchoring culture in L-DMEM with 10% fetal bovine serum by a full medium exchange every 3 days. The MSC surface antigens，including CD34，CD45，CD73，CD105，CD166，were analyzed on FACScan flow cytometer.  Unde

6、r culture in conditioned medium for osteogenesis (the hormone cocktail containing 0.1 mol/L dexamethasone，10 mmol/L glycerol-2-phosphate and 50 mol/L ascorbic acid) and adipogenesis (the cocktail containing 1 mol/L dexamethasone，5 mg/L insulin，0.5 mmol/L 1-methyl-3-isobutylxanthine and 60 mol/L indo

7、methacin)，MSCs committedly differentiated into osteoblasts and adipocytes. The differentiated mesenchymal stem cells were identified by morphological observation  and immunohistochemical staining. The results showed that  by gradient centrifugation and adhesion culture，MSCs could be isolat

8、ed and culture-expanded from human bone marrow aspirate. These cells were   uniformly negative for CD34，CD45 and positive for CD73，CD105 and CD166. The osteogenic differentiated cells were positive for alkaline phosphatase (ALP) and the adipogenic differentiated cells displayed accumulatio

9、n of lipid vacuoles，as detected by oil red O. It is concluded that  MSC can  be isolated and expand-cultured from adult human bone marrow aspirate and committedly differentiate into osteoblasts and adipocytes. MSC primary identification can be accomplished by  flow cytometry and induc

10、ed differentiation. The set of methods in current experiment shows somewhat practical value for basic research and clinical application.Key words  mesenchymal stem cell; isolation  method; identification method;  cell culture; committed differentiation間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）

11、是最早自骨髓中分離出的一類具有自我更新及多向分化潛能的組織干細胞1。作為多種骨髓基質(zhì)細胞的祖細胞，MSC具有穩(wěn)定和修復(fù)造血微環(huán)境，促進造血干細胞增殖、分化，調(diào)節(jié)淋巴細胞免疫功能，減輕移植排斥反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)2。MSC的發(fā)現(xiàn)為針對性解決造血干細胞移植，尤其是臍血移植中的干細胞數(shù)量相對不足及減少移植物抗宿主病提供了一個有效途徑3，4。本研究旨在建立一種從成人骨髓組織中分離、培養(yǎng)、擴增MSC的簡便易行的方法，通過流式細胞儀檢測細胞表面抗原和定向誘導(dǎo)分化，完成對獲得細胞的初步鑒定，為干細胞移植的臨床治療及組織損傷修復(fù)工程提供實驗基礎(chǔ)。材料和方法材料與試劑骨髓穿刺液5 ml取自于健康成人移植供者，肝素抗

12、凝，4保存。分離培養(yǎng)試劑：Percoll 細胞分離液（1.073 g/ml，Pharmacia產(chǎn)品），MSC專用培養(yǎng)基MesenCultTM （MSC basal medium and mesenchymal stem cell stimulatory supplements，Stem cell產(chǎn)品）和胎牛血清（FBS，Stem cell產(chǎn)品），低糖及高糖DMEM培養(yǎng)基（Dulbeccos modified Eagle medium，Gibco BRL產(chǎn)品），胰蛋白酶（Sigma產(chǎn)品）；誘導(dǎo)試劑：地塞米松（dexamethasone）、-甘油磷酸鈉（-glycerol-2-phosphate

13、disodium salt）、抗壞血酸磷酸鹽（ascorbic acid-2-phosphate salt）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、胰島素（insulin）、消炎痛（indomethacin）及堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒均為Sigma產(chǎn)品；流式相關(guān)抗體：鼠抗人單克隆抗體CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD166-PE（BD PharMigen產(chǎn)品）、CD105-FITC（SEROTEC產(chǎn)品）。主要儀器：細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶（Corning）；超凈工作臺（廣州醫(yī)學(xué)生物工程研究所，GX-型），細胞培

14、養(yǎng)箱（WTC binder），流式細胞儀（FACSCalibur，Becton Dickinson產(chǎn)品），倒置顯微鏡、照相機（Olympus），熒光顯微鏡、數(shù)碼相機（Nikon），低溫冷凍離心機（IEC centra）。方法人骨髓MSC的分離培養(yǎng)與傳代 無菌條件下用等量PBS稀釋肝素抗凝骨髓液，在10 ml消毒離心管中加入6 ml  Percoll分離液，再將4 ml稀釋的骨髓液小心加至分離液表面，820×g離心20分鐘；吸取分界面的白色絮狀細胞層，用低糖DMEM培養(yǎng)基混勻，300×g離心10分鐘，洗滌2次。按2×105/cm2密度接種于含MS

15、C專用培養(yǎng)基的75 cm2培養(yǎng)瓶，37、5% CO2培養(yǎng)箱全濕條件下培養(yǎng)48小時，全量換液，去除血細胞及其它未貼壁成分。用含10 FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況，每3天全量換液。細胞融合達80以上，加入0.10%-0.15%胰蛋白酶-EDTA溶液2.5 ml消化，按14或15傳代。取3代以上的細胞進行實驗。MSC表面抗原的檢測 取第3代生長達80%融合的貼壁細胞，用胰蛋白酶消化，計數(shù)后取2 ×106個細胞，分裝6管，每管加入10 l熒光標記抗體CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD105-FITC、CD166-PE，另設(shè)1管為空白對照，室溫避光30分鐘；用PBS反復(fù)洗2-3次，減少非特異性結(jié)合；加入200 l  PBS混勻細胞，并以1%多聚甲醛固定，4保存，24小時內(nèi)上流式細胞儀檢測。定向誘導(dǎo)MSC向成骨細胞分化的方法與鑒定 收集消化后細胞，按3 000 cells/cm2接種于6孔板或24孔板，待多數(shù)細胞貼壁后，換用含10FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，加入成骨誘導(dǎo)體系：地塞米松0.1  mol/L、-甘油磷酸鈉10 mmol/L、抗壞血酸磷酸鹽50 mol/L，每3天全量換液，維持2-3周。用堿性磷酸酶試劑盒染色。定向誘導(dǎo)MSC向脂肪細胞分化