低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定方法研究進(jìn)展(精)

1、低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定方法研究進(jìn)展nbsp;摘要 nbsp;血清或血漿中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)與冠心 病(CDH發(fā)生和動(dòng)脈粥樣硬化損傷呈正相關(guān)，而且是美國(guó)國(guó)家膽固醇教育計(jì)劃(NCEP 作為脂類疾病分類和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的一個(gè)重要指標(biāo)。LDL-C 也是選擇藥物治療和預(yù)后方面的一個(gè)十分有意義的臨床指標(biāo)，國(guó)張式鴻 俞純山 國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè) 1999 年 第 20卷第 4 期 摘要 血清或血漿中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)與冠心 病(CDH 發(fā)生和動(dòng)脈粥樣硬化損傷呈正相關(guān)，而且是美國(guó)國(guó)家膽固醇教育計(jì)劃(NCEP 作為脂類疾病分類和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的一個(gè)重要指標(biāo)。LDL-C 也是選擇藥物治

2、療和預(yù)后方面的一個(gè)十分有意義的臨床指標(biāo)，國(guó)內(nèi)外都在研究和開發(fā)行之有 效、可靠的標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定方法。本文對(duì)其有關(guān)的測(cè)定方法和研究進(jìn)展作綜述。 關(guān)鍵詞：低密度脂蛋白膽固醇；方法學(xué)；心血管疾病臨床和流行病學(xué)研究證明血清中 LDL-C 與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化有密切的正相關(guān)1。在 1986 年病理學(xué) 家們就研究證明 LDL-C 濃度越高時(shí)動(dòng)脈粥樣硬化損傷的程度越大，粥樣硬化程 度小時(shí)，測(cè)到血清中 LDL-C 也低2,3。1DL 是一組不均一的脂蛋白顆粒，一般認(rèn)為 LDL 的漂浮密度為 1.0061.063，且包括了中間密度脂蛋白(LDL) 1.006 1.019 及 Lp(a)1.050 1.080。LDL 中

3、蛋白含量約為 20% 25%，主要是載脂蛋白 B-100 (ApoB-100),而載脂蛋白 E (ApoE 和載脂蛋白 CH(ApoCn)含量很少。膽固醇的含量約是血清中總量的三分之二。LDL 是通過受體途徑進(jìn)行降解，如過量時(shí)可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和其他吞噬細(xì)胞變成泡沫細(xì) 胞，這被認(rèn)為是與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的因素。因此，LDL-C 的測(cè)定結(jié)果直接影響到分類和治療。美國(guó)的 NCEF 專家組以 LDL-C 濃度將成人、小孩、青少年各分 為：成人在 3.37mmol/L(1300mg/L) 以下為合適水平，在 3.37 4.12mmol/L(1300 1590mg/L)間作為中危水平，高于 4.14mmol

4、/L(1600mg/L)時(shí) 作為高危水平；小孩和青少年在 2.85mmol/L(1100mg/L) 以下為合適水平，在2.85 3.34 mmol/L(1100 1290mg/L)為中危水平，高于 3.37mmol/L(1300mg/L) 為高危水平4。為提高 LDL-C 測(cè)檢水平，國(guó)內(nèi)外對(duì) LDL-C 測(cè)定方法進(jìn)行廣泛的 研究并不斷改善，現(xiàn)將有關(guān)方法研究進(jìn)展綜述如下：1 等密度和密度梯度超速離心法血清中的各種脂蛋白的分離是 LDL-C 測(cè)定的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。由于各種脂蛋白的大小、密度和組成及功能都有很大的不同。超速離心技術(shù)就是 利用脂蛋白各種成分的密度不同將它們分離，是脂蛋白分離的主要方法。1

5、950 年 Delalla 和 Gofman 首次報(bào)道等密度超速離心法。在實(shí)驗(yàn)室中一般采用BQuantification(BQ)法，它利用 1.006 的臨界分離液，在離心力為10900g 時(shí)離心 18h，將血漿分成上下兩部分，上清液為 VLDL 和乳糜顆粒，下面 為IDL、LDL 和 HDL 用試管切開技術(shù)將上下液體分開。下面部分再采用化學(xué)沉 淀法將HDL 和 LDL 及 IDL 分開，分別用酶法測(cè)定膽固醇。這方法已被臨床實(shí)驗(yàn) 室作為參考方法。而且還可以根據(jù)需要改變分離液密度，當(dāng)密度提高為1.019，可以將 IDL 與 LDL 和 HDL 分開，也可提高到 1.21，分離出 HDL 等。但

6、在選擇脂蛋白分離切點(diǎn)系指它們與緩沖液混和物的密度，而不是脂蛋白自身的 密度。 另外有報(bào)道用密度梯度超速離心法 5 。這種方法是將血清加入到已有不同密度梯度的分離液中，進(jìn)行超速離心后，血清中脂蛋白的各種成份可 以轉(zhuǎn)移到各自相等密度的相等的區(qū)域。這種方法可以一次將脂蛋白中的各種成 份分離。而不足之處是要求離心時(shí)間很嚴(yán)格，分開各種組份較困難。根據(jù)離心轉(zhuǎn)子的不同，可以分為水平轉(zhuǎn)子，垂直轉(zhuǎn)子以及固定角度轉(zhuǎn)子。水平轉(zhuǎn)子在實(shí) 驗(yàn)中已被證明分離效果最好，但要求離心時(shí)間長(zhǎng)(1766h);垂直轉(zhuǎn)子可以縮 短時(shí)間(45min3h)，由于轉(zhuǎn)動(dòng)距離小，會(huì)有微量丟失；在等密度超速離心中 首選固定角度轉(zhuǎn)子，如在密度梯度超速

7、離心中使用時(shí)，離心時(shí)間要比垂直轉(zhuǎn)子 稍長(zhǎng)。 這兩種方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求條件高，一般實(shí)驗(yàn)室都難以應(yīng)用。雖然現(xiàn) 在有很多改良方法，克服了傳統(tǒng)方法的部分缺點(diǎn)，但分離的效果仍不能同傳統(tǒng) 方法比。所有的超速離心法都有它們的局限性，它們所測(cè)得的結(jié)果仍是NCEP 乍為分類和治療的指標(biāo)。2 譜法 根據(jù)脂蛋白分子的大小和親和性有很大的不同，利用層析技術(shù)對(duì)脂蛋白進(jìn)行分離。目前有多種色譜儀和分離柱被用 于脂蛋白的分離。而瓊脂糖層析技術(shù)和 Toya soda 的高壓凝膠層析技術(shù)使用最 普遍。這種方法是非破壞性， 可以回收各種成份， 有報(bào)道 6LDL-C 的回收率可 以達(dá)到 80 98，但穩(wěn)定性較差。目前這種技術(shù)也在不斷完

8、善，但要求實(shí)驗(yàn) 條件高，操乍繁瑣，時(shí)間長(zhǎng)，儀器昂貴，難以在臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。3 電泳電泳技術(shù)是基于脂蛋白分子所帶的電荷和分子量大小不同進(jìn)行分離，早期這種 技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室普遍用于定性分析，直接觀察血清脂蛋白譜?，F(xiàn)在已不再推 廣使用，大量實(shí)驗(yàn)證明電泳電量法所得的結(jié)果不能令人滿意，并且發(fā)現(xiàn)與常規(guī) 實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果有誤差。有報(bào)道 7 肝硬化膽道阻塞病人的血清脂蛋白譜顯示正 常，而血清膽固醇濃度追憶忼于 25.9mmol/L(10g/L) 。因此還應(yīng)進(jìn)行總膽固醇(TC 測(cè)定。因?yàn)橛H脂性染料不能和游離膽固醇以及磷脂結(jié)合。另外，可以與 超速離心法和化學(xué)沉淀法聯(lián)合使用，經(jīng)分離后，進(jìn)行某一組份純度分析。免疫 與電

9、泳技術(shù)結(jié)合，可以大大提高準(zhǔn)確度；以及全自動(dòng)電泳分析儀出現(xiàn)，在常規(guī) 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行脂蛋白定量分析將成為可能。4 化學(xué)沉淀法 4.1 肝素沉淀法 肝素在 pH 值 5.12 檸檬酸緩沖液中可以沉淀 LDL，使 LDL 與其它脂蛋 白分離，然后進(jìn)行膽固醇測(cè)定。這種方法pH 值很重要。pH 值必須使 LDL 顆粒的脂蛋白所帶電荷剛為正值。由于 VLDL 和 LDL 等電點(diǎn)分別為 4.7 和 5.4，pH 值 5.12 0.02 時(shí) LDL 剛好可以完全沉淀，而 VLDL 不沉淀。肝素沉淀法與定量電 泳法有很好的一致性，但當(dāng) TG 含量大于 4.58mmol/L(4000mg/L)時(shí)，一致性相 對(duì)降低。在川

10、型血漿脂蛋白增高癥的病人血清中加沉淀劑時(shí)VLDL 和 Lp(a)與LDL 發(fā)生共同沉淀，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。這種方法在TG 低時(shí)，它有很好的精密度，變異系數(shù)小于 3.5 %。與等密度超速離心法比較，當(dāng) TG 濃度大于2.0mmol/L(1750mg/L) 時(shí)，肝素法出現(xiàn)結(jié)果偏離 4 。近年 Armstrong 等8 實(shí)驗(yàn) 證明降低 pH 值到 4.85 時(shí) Lp(a)沉淀。4.2 聚乙烯硫酸(PVS 沉淀法含有 EDTA 勺 PVS 可將血清中 LDL 沉淀。 PVS 沉淀 LDL 是非離子相互作用， pH 值 影響較小，pH 值在 38 范圍內(nèi)均可以沉淀。因此，并不需要精確的pH 值。沉淀劑中

11、 EDTA 與血清中二價(jià)離子結(jié)合，阻止 VLDL 共同沉淀，而聚乙二醇獨(dú)甲醚(PEGME 加速 LDL 形成小球，可縮短沉淀時(shí)間。 Assmanr 等9實(shí)驗(yàn)證明 PVS 法可以將 LDL 同 HDL VLDL 和 LpX 分離，但 Lp(a)則完全同 LDL 共同沉淀，實(shí) 際結(jié)果應(yīng)包括 Lp(a)所含的膽固醇。當(dāng)血清中 TG 濃度小于 4.2mmol/L(3680mg/L)時(shí)，與超速離心法有很好的一致性，但當(dāng)TG 大于4.6mmol/L(4070mg/L)時(shí)，PVS 法所得結(jié)果偏低，且隨 TG 濃度的升高誤差也隨 著增大。當(dāng)血清 TG 低時(shí)，PVS 法與其它所有方法都有很好的一致性，且有好的

12、精確度，變異系數(shù)小于 3.0 %。4.3 多環(huán)表面活化法 本法采用 pH 值 6.10的異吡唑緩沖液中非特異兩歧性聚合物使LDL 沉淀，然后將沉淀物重新溶解直接測(cè)定 LDL-C 或有 TC 與上清液膽固醇之差計(jì)算出。Moss 等報(bào)道10此法與超速離心法和電泳法有很了的一致性，但與其他化學(xué)沉淀法一樣受血清中的TG 濃度影響。 5 Friedewald 公式計(jì)算法 1972 年 Friedewald 和 Levy 等 首次提出用公式計(jì)算：LDL C- TC- (HDL C+ VLDL- C),而 VLD C=TGX 0.45(mmol/L)或 VLD C- TGX 0.20(mg/L)。此公式是基

13、于 TG 和比率恒定 的情況與其它方法有很好的相關(guān)性，并要求空腹血清。如川型血漿脂蛋白增高 癥的病人血清 VLDL- C/TG 變化很大，且 TC TG HD C 測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性直 接影響到 LDLC結(jié)果。 如血活中TG升高時(shí)， LDL C結(jié)果偏低， 川型血漿脂蛋 白增高癥病人的LVDC/TG 的比率高達(dá)到 0.947(mmol/L) 11,12 。 因此此公 式在臨床上的運(yùn)用要求血清 TG的濃度小于 4.52mmol/L(4000mg/L)，否則會(huì)提 供錯(cuò)誤結(jié)果，會(huì)對(duì)分類和治療作出誤導(dǎo)。6 免疫結(jié)合分離法 這種方法根據(jù)血清脂蛋白中所含有載脂蛋白的種類和數(shù)量的差異， 制備有關(guān)載脂蛋白 的抗體

14、，通過免疫結(jié)合，達(dá)到相應(yīng)物質(zhì)的沉淀，得到所需的結(jié)果。由于LDL 含絕大部分 ApoB-100,達(dá)到 98% ;而 ApoA-l 和 apoE 卻很微量。1993 年 Leary 等13提出采用羊的多克隆抗 Apo-A1 和 ApoE 血清與乳膠顆粒結(jié)合，形成致敏 劑，然后與脂蛋白的 VLDL HDL IDL、乳糜顆粒等結(jié)合沉淀，分離出 LDL 并用 酶法測(cè)定膽固醇。與BQ 法作比較，空腹和非空腹血都有很好的一致性，相關(guān) 系數(shù)分別為 0.96 和 0.98，日內(nèi)變異系數(shù)小于 3%，日間變異系數(shù)小于 4%，后 來 Castellani 等14采用 Sigma提供的試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果 TG 高于 4

15、.29mmol/L(3800mg/L)和HDL-C2.55mmol/L(990mg/L)時(shí)不影響 LDL-C 結(jié)果。而 McNamara15則認(rèn)為上清液放在-80C冰凍時(shí)間越長(zhǎng)，結(jié)果變化越大，如放 置 26 周后，結(jié)果改變達(dá)-13.66 5.35%。而 Pisani 等16采用 200 卩 I 試劑加 入 30 卩 l 血清或血漿旋轉(zhuǎn)混勻，在室溫放置 510min,離心分離上清液作 LDL- C 測(cè)定。且用本方法和BQ 法分別對(duì) 177份血清進(jìn)行測(cè)定，兩方法的相關(guān)系數(shù) 為 0.980;分別對(duì) 29 份甘油三酯高于4.52mmol/L(4000mg/L) 的血清進(jìn)行測(cè)定。 相關(guān)系數(shù)為 0.927

16、。本方法有很好精密度，日內(nèi)和日間變異系數(shù)均小于3%。這種方法不要求用空腹血清，而且對(duì)高乳糜微粒血癥、高TG 血癥和川型血漿脂蛋白增高癥病人血清一樣可以精確測(cè)定。這種方法被美國(guó)NCEF 專家們推薦為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的方法。由上可知，目前測(cè)定 LDL-C 的各種方法仍存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)，密度梯度超速離心法仍是目前認(rèn)定的參考方法，國(guó)外也有把等密度超 速離心法和化學(xué)沉淀法相互結(jié)合的BQ 法作為金標(biāo)準(zhǔn)?；瘜W(xué)沉淀法設(shè)備簡(jiǎn)單。較易開展，但它們共同的一個(gè)特點(diǎn)，結(jié)果的準(zhǔn)確度與TG 的水平有關(guān)，而且分離不夠完全。Friedewald 公式計(jì)算法，要求空腹血清，且血清的TG 乳糜微粒濃度低時(shí)結(jié)果才能可靠。近年還有報(bào)道

17、17 此公式還受其它疾病的影響，化學(xué)沉 淀法和 Friedewald 法得到 LDL-CA 結(jié)果， 還包括 Lp(a)-C 的濃度， 近年有報(bào)道 18 LDL-C和 Lp(a) 是反映血管疾病的兩個(gè)獨(dú)立因素，并提出應(yīng)分別測(cè)定，讓 LDL-C 和 Lp(a)各自更好提供冠心病以及動(dòng)脈粥樣硬化的臨床意義。免疫結(jié)合分 離法是上述各種方法中一種操作和設(shè)備都較簡(jiǎn)便的方法，不受血清的來源和血 清中 TG 乳糜微粒以及其它疾病的干擾，結(jié)果可靠適合于一般實(shí)驗(yàn)室使用，在 國(guó)外已有試劑盒提供，國(guó)內(nèi)由于試劑原因，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)推廣。參考文獻(xiàn) 1 backorilk PS.Ross JW.Clin,1995;41(

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