鮮活水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的HPLC測定

1、鮮活水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的hplc測定 一、試驗目的 把握hplc測定鮮活水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無色孔雀石綠含量的原理和辦法。 二、試驗原理 孔雀石綠為一種三苯甲烷類分子，當孔雀石綠進入機體14h后，約80的孔雀石綠代謝為無色孔雀石綠，所以在測定水產(chǎn)品中孔雀石綠的同時，更需要測定無色孔雀石綠的殘留。 試樣中殘留的孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無色孔雀石綠，以乙腈一乙酸鹽緩沖混合液提取、乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷層并濃縮，經(jīng)酸性氧化鋁柱凈化后，用高效液相色譜一pb0。柱后衍生法測定，外標法定量。 三、儀器與試材 1儀器與器材 hplc儀(配紫外可見光檢測器)、固相萃取裝置、組織搗碎機、勻漿

2、機、離心機。 2試劑 除特殊解釋外，試驗所用試劑均為分析純，水為去離子水或重蒸餾水。 (1)常規(guī)試劑與溶液：乙腈(色譜純)、二氯甲烷、甲醇(色譜純)、二甘醇、酸性氧化鋁 (80120目)、二氧化鉛、硅藻土545(色譜級)、乙酸鹽緩沖液(將495g無水naac與095g對甲苯磺酸溶于950ml水中，用冰醋酸調(diào)整溶液ph到45，定容至1l)、鹽酸羥胺溶液(20)、對甲苯磺酸溶液(10moli。)、nh。ac緩沖溶液(50mmoll，將385g無水nh4ac溶解于1000ml水中，用冰醋酸調(diào)ph到45)。 (2)孔雀石綠、無色孔雀石綠標準溶液(1gml)：稱取適量純度大于98的孔雀石綠、隱色孔雀石綠

3、，以乙腈分離配制成100gmi。的標準儲備液，再用乙腈稀釋配制成1“gml的標準溶液。于一18避光保存。 (3)孔雀石綠、無色孔雀石綠混合標準工作溶液：用乙腈稀釋標準溶液，配制成每毫升含孔雀石綠、隱色孔雀石綠均為20ng的混合標準工作溶液。于一18避光保存。 3試驗材料 34種不同種類的鮮活水產(chǎn)品，各500g左右。 四、試驗步驟 1樣品提取 (1)稱取100g樣品于組織搗碎機中搗碎混勻。 (2)取500g搗碎樣品于50ml離心管中，加入15ml鹽酸羥胺溶液、25ml對甲苯磺酸溶液、50ml乙酸鹽緩沖溶液，用勻漿機以10000rmin的速度均質(zhì)30s，加入10ml乙腈強烈振搖，30s后，再加入5

4、g酸性氧化鋁，再振蕩30s。 (3)以3000rmin離心10min后，將上清液轉(zhuǎn)移至裝有10ml水和2ml二甘醇的100ml離心管中。 (4)沉淀以10ml乙腈混勻后，以3000rmin離心l0min，將上清轉(zhuǎn)移至另一支裝有l(wèi)0mi 水和2ml，二甘醇的100ml離心管中。將2支100ml離心管離心后，合并乙腈層于離心管中，作為樣品提取液。 2樣品凈化 (1)在離心管中加入15ml二氯甲烷，振蕩10s，以3000rmin離心10min，將二氯甲烷層轉(zhuǎn)移至100ml的梨形瓶中，再用5ml乙腈、10ml二氯甲烷重復上述操作一次。 (2)合并二氯甲烷層于100ml梨形瓶中，于45旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1ml

5、，以25ml乙腈溶解殘渣。 (3)將酸性氧化鋁柱(1g，用法前用5ml乙腈活化)安裝在固相萃取裝置上后，將上述梨 形瓶中的乙腈溶液轉(zhuǎn)移到柱上，并以乙腈洗滌瓶兩次，每次25ml，將洗滌液依次通過柱，控制流速不超過06mlmin，收集所有流出液，于45旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。 (4)用05ml乙腈溶解殘液，并過045m濾膜，濾液作為樣品凈化液供液相色譜測定。 3測定 (1)測定：按照樣品凈化液中孔雀石綠、無色孔雀石綠的含量狀況，選定峰高相近的標準工作溶液。對標準：亡作溶液和樣液，根據(jù)以下參考色譜條件，等體積參插進樣測定。同時，舉行空白實驗(除不加試樣外，均按上述測定步驟舉行)。 (2)參考色譜條件：色譜柱

6、為c18柱250mm46mm(內(nèi)徑)，粒度5m，在c18色譜柱和檢測器之間銜接25pbo2氧化柱不銹鋼預柱管5cm4mm(內(nèi)徑)，兩端附2“m過濾板，抽真空條件下，填裝含有25pb()。的硅藻土，添加數(shù)滴甲醇壓實，旋緊。臨用前以甲醇沖洗；流淌相為乙腈和乙酸銨緩沖溶液，所給參數(shù)舉行梯度洗脫，流速為1omlrain；柱溫為室溫；檢測波長為618nm；進樣量為50l。 4計算 樣品中孔雀石綠與無色孔雀石綠的殘留量按下式計算，并扣除空白值。樣品中孔雀石綠的殘留量以兩者之和表示。 x=cav/asm 式中，x為樣品中待測組分的殘留量，mgkg；c為待測組分標準工作液的濃度，肚gmi。；a為樣品中待測組分的峰面積；as為待測組分標準工作液的峰面積；v為樣液的終于定容體積，ml；m為終于樣液所代表的試樣量，g。 五、注重事項 1試驗步驟中的色普條件僅供參考，詳細條件應(yīng)按照儀器設(shè)備型號和試驗室條件舉行調(diào)節(jié)。 2在本試驗條件下，孔雀石綠與無色孔雀石綠的保留時光約為610min和1777min，檢測限均為2.0gkg