蛋白質濃度的測定(四)──考馬斯亮藍染色法

1、實驗九 蛋白質濃度的測定(四考馬斯亮藍染色法 目的要求 學習考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）法測定蛋白質濃度的原理和方法。 實驗原理 考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法?？捡R斯亮藍G250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。它和蛋白質通過范德華力結合，在一定蛋白質濃度范圍內(nèi)，蛋白質和染料結合符合比爾定律（Beers law）。此染料與蛋白質結合后顏色有紅色形式和藍色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的

2、量。蛋白質和染料結合是一個很快的過程，約2min即可反應完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1h，之后，蛋白質染料復合物發(fā)生聚合并沉淀出來。蛋白質染料復合物具有很高的消光系數(shù)，使得在測定蛋白質濃度時靈敏度很高，在測定溶液中含蛋白質5µL/ml時就有0.275光吸收值的變化，比Lowry法靈敏4倍，測定范圍為10100µg蛋白質，微量測定法測定范圍是110µg蛋白質。此反應重復性好，精確度高，線性關系好。標準曲線在蛋白質濃度較大時稍有彎曲，這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊，試劑背景值隨更多染料與蛋白質結合而不斷降低，但直線彎曲程度很輕，不影響測定。此方法干擾物少，

3、研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4無干擾。強堿緩沖液在測定中有一些顏色干擾，這可以用適當?shù)木彌_液對照扣除其影響。Tris，乙酸，2巰基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污劑如Triton X100，SDS，玻璃去污劑有少量顏色干擾，用適當?shù)木彌_液對照很容易除掉。但是，大量去污劑的存在對顏色影響太大而不易消除。  試劑與器材 一、試劑考馬斯亮藍試劑：考馬斯亮藍G250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000ml，濾紙過濾。最終試劑中含0.01%(W/V考馬斯亮藍G250，4.7%(W/V乙

4、醇。 二、標準和待測蛋白質溶液1標準蛋白質溶液結晶牛血清蛋白，預先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。2未知蛋白質溶液。 三、器材試管及試管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV2000型分光光度計。  操作方法 一、標準法制定標準曲線取14支試管，分兩組按下表a平行操作。繪制標準曲線：以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。表a試管編號01234561mg/ml標準蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.060.

5、15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.050.04考馬斯亮藍試劑/ml5ml搖勻，1h內(nèi)以0號管為空白對照，在595nm處比色A595nm  二、微量法制定標準曲線取12支試管，分兩組按下表b平行操作。繪制標準曲線：以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。表b試管編號0123451mg/ml標準蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.15mol/L NaCl/ml0.10.090.080.070.060.05考馬斯亮藍試劑/ml5ml搖勻，1h內(nèi)以0號管為空白對照，在595nm處比色A595

6、nm 三、未知樣品蛋白質濃度測定測定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測定值在標準曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測定的A595nm值，在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度（mg/ml）。  注意事項 （1） （1） 如果測定要求很嚴格，可以在試劑加入后的520min內(nèi)測定光吸收，因為在這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。（2） （2） 測定中，蛋白染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上，實驗證明此復合物的吸附量是可以忽略的。測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。  思考題：根據(jù)下列所給的條件和要求，選擇一種或幾種常用蛋白質定量方法測定蛋白質的濃度：（1） （