細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞生死狀態(tài)的鑒別精編版

1、最新資料推薦【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 學(xué)習(xí)并掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)菌操作技術(shù)。2. 了解并掌握用組織塊貼壁培養(yǎng)法和消化細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方法。3. 熟練掌握動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方法。4. 學(xué)習(xí)細(xì)胞生死狀態(tài)鑒別的方法。5. 了解細(xì)胞生死狀態(tài)鑒別的原理。6. 熟悉和掌握各種鑒別細(xì)胞生死狀態(tài)方法的判定特征?！緦?shí)驗(yàn)原理】1. 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)指的是在無(wú)菌條件下，把動(dòng)、植物細(xì)胞從組織中取出，在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán) 境，使離體的細(xì)胞在體外生長(zhǎng)和繁殖， 并且維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。 從供體獲得組織細(xì)胞， 在無(wú)菌條件下， 用胰蛋白酶消化或機(jī)械分 散

2、等方法，將動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞開始首次培養(yǎng)長(zhǎng)出單層細(xì)胞的方法稱為細(xì)胞的原代培 養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)增殖達(dá)到一定密度， 形成致密的單層細(xì)胞時(shí)， 用胰蛋白酶將細(xì)胞消 化分散成單細(xì)胞，從一個(gè)容器中以 1：2 或其他比例轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，稱 為細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的累計(jì)次數(shù)就是細(xì)胞的培養(yǎng)代數(shù)。高等生物是由多細(xì)胞構(gòu)成的整體，在整體條件下要研究單個(gè)細(xì)胞或某一群細(xì)胞在體內(nèi)的功 能活動(dòng)是十分困難的。 但如果把活細(xì)胞拿到體外培養(yǎng)、 增殖并進(jìn)行觀察和研究， 則要方便和簡(jiǎn) 單得多。被培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞是非常好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象和實(shí)驗(yàn)研究材料， 對(duì)體外培養(yǎng)的活細(xì)胞進(jìn)行研 究可以幫助人類揭開生、 老、病、

3、死的規(guī)律， 探索優(yōu)生、抗衰老和防治各種疾病的途徑和機(jī)制， 也可以人為地誘導(dǎo)和改變細(xì)胞的遺傳性狀和特性， 使其向有利于人類健康長(zhǎng)壽的方向發(fā)展。 因 此動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)是研究細(xì)胞分子機(jī)制非常重要的實(shí)驗(yàn)手段， 被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、 生物 技術(shù)、基因工程等研究領(lǐng)域。2. 細(xì)胞生死狀態(tài)的鑒定細(xì)胞生死狀態(tài)的鑒別方法主要是化學(xué)染色法和熒光染色法?；罴?xì)胞和死亡細(xì)胞在生理技能和性質(zhì)上主要存在一下差異：細(xì)胞膜通透性的差異：活細(xì)胞的細(xì)胞膜是一種選擇性膜， 對(duì)細(xì)胞起保護(hù)和屏障作用， 只允許物質(zhì)選擇性地通過(guò)； 而細(xì)胞 死后，細(xì)胞膜受損，其通透性增加?；诖?，發(fā)展出了以臺(tái)盼藍(lán)、伊紅、苯胺黑、赤蘚紅、甲 基藍(lán)以及熒光染料

4、碘化丙啶或溴化乙啶等為染料鑒別細(xì)胞生死狀態(tài)的方法， 上述染料能使死亡 細(xì)胞著色，而活細(xì)胞不被著色。 此外，應(yīng)用植物質(zhì)壁分離的性質(zhì)也可鑒定植物細(xì)胞的生死狀態(tài)。 活細(xì)胞的原生質(zhì)具有選擇透過(guò)性， 死細(xì)胞因其原生質(zhì)的選擇透過(guò)性已遭破壞， 故與高滲透壓溶 液接觸時(shí)不產(chǎn)生質(zhì)壁分離。 代謝上的差異：活細(xì)胞中新陳代謝作用強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)的酶具有較 強(qiáng)的活性和還原能力?；诖耍l(fā)展處了以熒光素二乙酸酯（FDA、熒光素二丙酸酯、熒光素 二丁酸酯或熒光素二苯甲酰酯等酯化的熒光素鑒別細(xì)胞生死狀態(tài)的方法， 上述酯化的熒光素親 脂性提高， 容易被細(xì)胞吸收進(jìn)入， 活細(xì)胞內(nèi)的酯酶具有較強(qiáng)的活性， 可將酯化的熒光素分解而 釋放出能發(fā)

5、熒光的熒光素， 該物質(zhì)不能自由透過(guò)活的細(xì)胞膜， 積累在細(xì)胞內(nèi)， 熒光顯微鏡下顯 示有明亮的綠色或黃綠色熒光； 而死亡細(xì)胞內(nèi)的酯酶因失去活性， 不能分解酯化的熒光素， 熒 光顯微鏡下顯示不發(fā)光。 另外，可用亞甲基藍(lán)為染料鑒定酵母細(xì)胞的生死狀態(tài)。 亞甲基藍(lán)是一 無(wú)毒染料，氧化型為藍(lán)色，還原型為無(wú)色?；罴?xì)胞因具有較強(qiáng)的還原能力，能使亞甲藍(lán)從藍(lán)色 的氧化型變成無(wú)色的還原型， 故活的酵母細(xì)胞在用亞甲基藍(lán)染色后顯示無(wú)色； 死亡酵母細(xì)胞或 代謝緩慢的衰老酵母細(xì)胞， 因無(wú)還原能力或還原能力極弱， 使亞甲藍(lán)仍處于氧化態(tài)， 故呈現(xiàn)藍(lán) 色或淡藍(lán)色。【實(shí)驗(yàn)材料】1. 超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)、眼科剪、眼科鑷

6、、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、離心管、微量 加樣器、吸管、酒精燈；小鼠、培養(yǎng)基2. 血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片、滴管、顯微鏡；培養(yǎng)的小鼠脾臟細(xì)胞、臺(tái)盼藍(lán)、伊紅【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 取材取小白鼠一只，采用斷頭法處死：清水洗小鼠并浸于75%酒精中滅菌 5 分鐘。取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)內(nèi)的解剖盤內(nèi)，無(wú)菌操作打開腹腔。取出脾臟，去除其周圍的脂肪組織，鑷起脾 臟用PBS液自上而下沖洗1 2次。轉(zhuǎn)入無(wú)菌玻璃培養(yǎng)皿，待用。2. 分離脾細(xì)胞用滴管先向上述無(wú)菌玻璃培養(yǎng)皿中滴入 PBS液30滴，再用“ L”型針頭注射器在皿中吸取 PBS液 0.2ml，然后將其沿脾長(zhǎng)軸方向注射入脾內(nèi)（使脾臟膨脹以利于細(xì)胞散開）。用針尖在脾臟上扎眼，并用“ L

7、”針頭輕刮脾臟表面擠出脾細(xì)胞，用滴管吸皿中的PBS液沖脾臟并吹散刮出的脾細(xì)胞，稍傾斜并靜置 12分鐘。吸取上述靜置后的脾細(xì)胞懸液上清部分放入 Eppendof管，并使量至1ml，以3000"分離 1 2 分鐘。3. 培養(yǎng)脾細(xì)胞超凈工作臺(tái)中取塑料培養(yǎng)皿一個(gè)，用“槍（1ml）”加入細(xì)胞培養(yǎng)液2ml，并在皿蓋上畫上 標(biāo)記，待用。取上述離心后的Eppendof管，在超凈工作臺(tái)內(nèi)開蓋棄去上清液，用“槍（200卩l(xiāng) ）”吸取 塑料皿中的培養(yǎng)液400卩l(xiāng)加入棄去上清液的Eppendof管中，用槍頭吹勻管底的脾細(xì)胞， 然后吸取200卩l(xiāng)脾細(xì)胞懸液接種于上述塑料培養(yǎng)皿中，混勻，然后放入37C、5%二氧

8、化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4. 臺(tái)盼藍(lán)法鑒定細(xì)胞的生死狀態(tài)：（ 1） 試劑配制：用生理鹽水配置 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液，備用。（ 2） 細(xì)胞懸液制備：將生長(zhǎng)有貼壁型細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（皿）中的培養(yǎng)液倒入干凈試管中，向培養(yǎng)瓶（皿）中加入 0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml，靜置3-5min，待見(jiàn) 到細(xì)胞變圓，彼此不連接為止，棄去混合消化液并將上述試管中的培養(yǎng)液倒回培養(yǎng)瓶中， 用滴管輕輕吹打細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。（3）染色制片：取0.5ml細(xì)胞懸液放于干凈的試管中，加 1-2滴（約0.1ml）染液，混 合， 2min 后制成臨時(shí)裝片，鏡檢。（ 4） 染色結(jié)果：死細(xì)胞染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色?；蛘?/p>

9、（3）染色計(jì)數(shù)：取0.5ml細(xì)胞懸液放于干凈的試管中，加 1-2滴（約0.1ml）染液，混 合2-5min，滴加少許染色后的細(xì)胞懸液于放有蓋片的血球計(jì)數(shù)板的斜面上，使懸液自然充 滿計(jì)數(shù)板小室。注意不要使小室內(nèi)有氣泡產(chǎn)生，否則要重新滴加。在普通光鏡10'物鏡下計(jì)數(shù)四個(gè)大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，壓線者數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。（ 4） 根據(jù)染色結(jié)果計(jì)算活細(xì)胞率：依據(jù)死細(xì)胞染成藍(lán)色、活細(xì)胞不著色的原則計(jì)數(shù)死細(xì) 胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，以如下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率 =（細(xì)胞總數(shù) -死亡細(xì)胞數(shù)） /細(xì)胞總數(shù) *100% 附：血球計(jì)數(shù)板血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有四條槽而構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)

10、 較寬，其中間又被一短橫槽分割成兩半，每個(gè)半邊上面各有有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共 分九大格，其中間的一大格（又稱計(jì)數(shù)室）常被用作細(xì)胞的計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)室的刻度有兩種： 一種是大方格分為 16個(gè)中方格,而每個(gè)中方格又分成 25個(gè)小方 格；另一種是一個(gè)大方格分成 25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成 16個(gè)小方格。但是不管 計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造，他們都有一個(gè)共同特點(diǎn)，即每個(gè)大方格都有 400 個(gè)小方格組成。每個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1mm則每一大方格的面積為1mm每個(gè)小方格的面積為1/400mrr,蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計(jì)數(shù)室底部之間的高度為0.1mm所以每個(gè)計(jì)數(shù)室（大方格）的體積為0.1mm3所以每個(gè)小方格的體積為1

11、/400mnm若取四個(gè)大方格的細(xì)胞數(shù)，貝 每毫升液體中細(xì)胞的數(shù) =每個(gè)大方格中的細(xì)胞數(shù)量 *10000*稀釋倍數(shù)【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】死細(xì)胞活細(xì)胞項(xiàng)目左上左下右上右下中總細(xì)胞148161715死細(xì)胞75895細(xì)胞存活率=(細(xì)胞總數(shù)-死亡細(xì)胞總數(shù))/細(xì)胞總數(shù)X100%(14+8+16+17+15-(7+5+8+9+5) / (14+8+16+17+15*100%=51.43%每毫升液體中細(xì)胞的數(shù)=(70/5)*25*(16/25)*10000=3500000【實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析】1. 活細(xì)胞邊緣較明顯，而求細(xì)胞膜維持正常的選擇透過(guò)性，染料無(wú)法通過(guò)，所以呈現(xiàn)透明無(wú) 色2. 死細(xì)胞由于細(xì)胞膜不再具有生物活性，染料從

12、細(xì)胞膜通過(guò)，將細(xì)胞染色，且死細(xì)胞的邊緣 不明顯。3. 將培養(yǎng)基剛從培養(yǎng)箱拿出來(lái)時(shí)，培養(yǎng)基的顏色應(yīng)呈現(xiàn)無(wú)色（由于細(xì)胞的代謝產(chǎn)物為酸性以 及培養(yǎng)箱中的二氧化碳濃度較高），過(guò)一段時(shí)間后漸漸恢復(fù)粉紅色。4. 用倒置顯微鏡觀察時(shí)，可以看到在黃色的背景下有一些透明的細(xì)胞?！咀⒁馐马?xiàng)】1. 在進(jìn)行方格查數(shù)時(shí)注意：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)下不數(shù)上。2. 實(shí)驗(yàn)涉及的臺(tái)盼藍(lán)染料有致癌危險(xiǎn)，因此滴加染液時(shí)要小心，防止濺到皮膚上。3. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)使用的所有器皿、用具、溶液等必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格消毒或除菌處理，才能進(jìn)超凈 工作臺(tái)中使用，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程都要有無(wú)菌操作的概念，避免細(xì)胞被污染。4. 在超凈工作臺(tái)內(nèi)點(diǎn)燃酒精燈后，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在火焰的附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上 燒灼，金屬器械燒灼后要待其冷卻才能夾取組織，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)液的用具不能長(zhǎng)時(shí)間燒灼，以 免燒焦形成碳膜。5. 超凈工作臺(tái)內(nèi)吸取溶液用的的各種吸管等不能混用，以免相互污染。6. 在超凈工作臺(tái)中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能敞開暴露過(guò)久，以免溶液蒸發(fā)和 pH 變化。7. 器皿、離心管培養(yǎng)瓶等在離開超凈工作臺(tái)前必須將蓋子或橡皮塞蓋緊，以防止細(xì)胞污染或溶液漏出。【 反思與總結(jié) 】1. 做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候由于顯微鏡的光線問(wèn)題，死細(xì)胞的顏色有時(shí)不太明顯，在觀察