降血糖動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1、輔助降血糖作用檢驗(yàn)方法1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.1 動(dòng)物選擇選用健康成年動(dòng)物，常用小鼠（252g）或大鼠（18020g）,單一性別，大鼠每組8-12只、小鼠每組 10-15 只。1.2 材料1.2.1 試劑四氧嘧啶 （或鏈脲霉素） 小鼠 35-50mg/kg.bw.iv（ 100-160mg/kg.bw.ip ） 、 大鼠 50-80mg/kg.bw.iv（ 200-250mg/kg.bw.ip ）用新鮮配制。血溏測(cè)定試紙或試劑盒。1.2.2 儀器血糖儀、全自動(dòng)生化儀、 721-B 型分光光度計(jì)。1.3 劑量分組及受試樣品給予時(shí)間設(shè) 1 個(gè)溶劑對(duì)照組和3 個(gè)受試樣品劑量組， 根據(jù)人體每日每公斤體重推薦攝

2、入量，小鼠擴(kuò)大 10 倍作為其中一個(gè)劑量組 （大鼠擴(kuò)大5 倍） ， 根據(jù)受試樣品的具體情況另設(shè)兩個(gè)劑量組。受試樣品給予時(shí)間原則上不少于30 天，也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行設(shè)定期限。1.4 實(shí)驗(yàn)方法1.4.1 降低空腹血糖實(shí)驗(yàn)1.4.1.1 高血糖模型動(dòng)物1.4.1.1.1 原理四氧喀咤（或鏈月尿霉素）是一種3細(xì)胞毒劑，可選擇性地?fù)p傷多種動(dòng)物的胰島3細(xì)胞，造成胰島素分泌低下引起實(shí)驗(yàn)性糖尿病。1.4.1.1.2 造型動(dòng)物禁食24 小時(shí)后，給予四氧嘧啶造型， 5-7 天后禁食3-5 小時(shí)，測(cè)血糖，血糖值10-25mmol/L 為高血糖模型成功動(dòng)物。1.4.1.1.3 操作步驟選高血糖模型動(dòng)物按禁食3-5

3、小時(shí)的血糖水平分組，隨機(jī)選 1 個(gè)模型對(duì)照組和 3 個(gè)劑量組（組間差不大于1.1mmol/L ） 。 劑量組給予不同濃度受試樣品， 模型對(duì)照組給予溶劑， 連續(xù)30 天，測(cè)空腹血糖值（禁食同實(shí)驗(yàn)前） ，比較各組動(dòng)物血糖值及血糖降低的絕對(duì)值（即實(shí)驗(yàn)前后血糖的差值） 。1.4.1.2 正常動(dòng)物選健康成年動(dòng)物按禁食3-5 小時(shí)的血糖水平分組， 隨機(jī)選 1 個(gè)對(duì)照組和 1 個(gè)受試樣品組 （高劑量） 。余操作同 1.4.1.1.3。1.4.2 糖耐量實(shí)驗(yàn)高血糖模型動(dòng)物禁食3-5 小時(shí)，劑量組給予不同濃度受試樣品，模型對(duì)照組給予同體積溶劑， 15-20 分鐘后經(jīng)口給予葡萄糖2.0g/kg 或醫(yī)用淀粉 3-5

4、2.0g/kg ，測(cè)定給葡萄糖后0、 0、5、 2 小時(shí)的血糖值或人醫(yī)用淀粉后 0、 1、 2 小時(shí)的血糖值， 觀察模型對(duì)照組與受試樣品組給葡萄糖或醫(yī)用淀粉后各時(shí)間點(diǎn)血糖曲線下面積的變化。血糖曲線下面積=1/2 X （0小時(shí)血糖值+0.5小時(shí)血糖值）X 0.5+1/2X （2小時(shí)血糖值+0.5 小時(shí)血糖值）X 1.5=0.25 X （0小時(shí)血糖值+4X0.5小時(shí)血糖值+3X2小時(shí)血糖值）.1.5 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F 值， F值 降空腹血糖實(shí)驗(yàn)： 受試樣品劑量組與對(duì)照組比較，空腹血糖實(shí)測(cè)值降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可判定該受試樣品降

5、空腹血糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。糖耐量實(shí)驗(yàn)：受試樣品劑量組與對(duì)照組比較，在給葡萄糖或醫(yī)用淀粉后、 0.0、 0.5 、 2.0 小時(shí)血糖曲線下面積降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可判定該受試樣品糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。1.6 注意事項(xiàng)1.6.1 為了使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糖代謝功能狀態(tài)盡量保持一致， 也為了準(zhǔn)確地按體重計(jì)算受試樣品的用量，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物應(yīng)嚴(yán)格禁食（不禁水） ，實(shí)驗(yàn)前后禁食條件應(yīng)一致，鼠類在禁食的同時(shí)應(yīng)更換襯墊物。1.6.2 血糖測(cè)定用試紙或試劑盒，按說明書操作；若自行配制試劑，按附 1操作。1.6.3 如用血清樣品進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)于取血后30 分鐘內(nèi)分離血清，分離后血清的含糖量在6小時(shí)內(nèi)不變。用血清制備的無蛋白血濾液可保存4

6、8 小時(shí)以上。1.6.4 高濃度的還原性物質(zhì)如 Vit C 亦能與色素原競(jìng)爭游離氧，干擾反應(yīng)，使結(jié)果偏低。血紅蛋白能使過氧化氫過早分解，亦干擾反應(yīng)，致使測(cè)得血糖值偏低。故對(duì)已溶血的全血或血清必須制備無蛋白濾液后，再進(jìn)行測(cè)定。附 1血糖值測(cè)定方法1 原理葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶， 能催化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫， 后者在過氧化物酶作用下放出氧，使4-氨基安替比林與酚氧化縮合，生成紅色醌類化合物，可在波長505nm 比色測(cè)定。2 試劑配制磷酸鹽緩沖液（ 0.2mol/L, PH7.0 ）0.2mol/L Na2HPO4 61ml ， 0.2mol/L KH2HPO4 39ml 混合即可。酶

7、試劑葡萄糖氧化酶400u,過氧化物酶0.6mg,4-氨基安替比林10mg,疊氮鈉100mg加磷酸鹽緩沖液至 100ml ， PH 調(diào)至7。冰箱存放至少可穩(wěn)定2 個(gè)月。酚試劑酚 100mg 溶于 100ml 蒸餾水中。酶混合試劑取等量酶試劑和酚試劑混合。在冰箱中可存放1個(gè)月。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液儲(chǔ)存液：無水 D-葡萄糖(A.R.)在烤箱中80c烤4小時(shí)，冷卻后，存放于干燥器中至恒重。精確稱取2g以0.25%苯甲酸溶液溶解并移入 100ml容量瓶中，再用苯甲酸溶液稀釋至 100ml。應(yīng)用液：在100ml容量瓶中準(zhǔn)確加入儲(chǔ)存液5ml,再用0.25%苯甲酸溶液稀釋至 100ml,即1mg/mL應(yīng)用液。蛋白沉淀

8、劑溶解磷酸氫二鈉 10g、鴇酸鈉10g、氯化鈉9g于800ml蒸儲(chǔ)水中，加入1mol/L鹽酸125ml,并用蒸儲(chǔ)水稀釋至 1000ml。3操作步驟取蛋白沉淀劑1ml加入血漿(血清)50ul混勻。室溫放置7分鐘后，離心，取上清液(無蛋白血濾液)測(cè)定。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液亦進(jìn)行同樣處理。測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管無蛋白血濾液 mL0.5-處埋后的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 mL-0.5-蛋白沉淀液mL0.5酶混合試劑mL444混勻后，37c水浴保溫15分鐘，用空白管調(diào)零點(diǎn)，在波長 505nm處比色。4結(jié)果計(jì)算2人體試食試驗(yàn)2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)采用隨機(jī)分組，組間和自身兩種對(duì)照設(shè)計(jì)。2.2 受試產(chǎn)品受試產(chǎn)品必須是具有定型包裝、

9、標(biāo)明服用方法服用量的定型產(chǎn)品；安慰劑除功效成分外， 在劑型、口感、外觀和包裝上與受試產(chǎn)品保持一致。2.3 受試者選擇2.3.1 納入標(biāo)準(zhǔn)選擇經(jīng)飲食控制或口服降糖藥治療后病情較穩(wěn)定，不需要更換藥物品種及劑量， 僅服用維持量的成年 II型糖尿病病人，空腹血糖 7.8mmol/L (140mg/dl )或餐后 2h血糖 11.1mmol/L ( 200mg/dl );也可選擇 7.8mmol/L 空腹血糖6.7mmol/L (120mg/dl )或 11.1mmol/L 餐后2h血糖 7.8mmol/L的高血糖人群。2.3.2 排除標(biāo)準(zhǔn)2.3.2.1 I型糖尿病病人。2.3.2.2 年齡在18歲以下

10、或65歲以上，妊娠或哺乳期婦女，對(duì)受試樣品過敏者。2.3.2.3 有心、肝、腎等主要臟器并發(fā)癥，或全并有其它嚴(yán)重疾病，精神病患者，服用糖皮 質(zhì)激素或其它影響血糖藥物者。2.3.2.4 不合作者（指不能配合飲食控制而影響觀察結(jié)果者）。2.3.2.5 近3個(gè)月內(nèi)有糖尿病酮癥、酸中毒以及感染者。2.3.2.6 凡不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，未按規(guī)定服用受試樣品，或資料不全影響觀察結(jié)果者。2.4 受試者分組按受試者的血糖水平隨機(jī)分為試食組和對(duì)照組，盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如病程、 服藥種類（黃月尿類、雙月瓜類）等，進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)，以保證組間的可比性。每組受度者不 少于50例。、2.5 試驗(yàn)方法試驗(yàn)前對(duì)每一位受

11、試者按性別、年齡、不同勞動(dòng)強(qiáng)度、理想體重參照原來生活習(xí)慣規(guī)定相 應(yīng)的飲食，試食期間堅(jiān)持飲食控制，治療糖尿病的藥物種類和劑量不變。試食組在服藥的 基礎(chǔ)上，按推薦服用方法服用量每晶是食受試樣品，對(duì)照組在服藥的基礎(chǔ)上，可不進(jìn)行任 何處理（或服用安慰劑）。連續(xù)觀察時(shí)間不少于 30天，必要時(shí)可以適當(dāng)延長。2.6 觀察指標(biāo)各項(xiàng)指標(biāo)于實(shí)驗(yàn)開始及結(jié)束各檢測(cè)一次，必要時(shí)實(shí)驗(yàn)中期血糖指標(biāo)可加測(cè)一次。2.6.1 安全性指標(biāo)2.6.1.1 一般狀況體征 包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等2.6.1.2 血、尿、便常規(guī)檢查2.6.1.3 肝、腎功能檢查2.6.1.4 胸透、心電圖、腹部 B超檢查（僅試驗(yàn)前檢查一次）2

12、.6.2 功效指標(biāo)2.6.2.1 癥狀觀察詳細(xì)詢問病史，了解患者飲食情況，用藥情況，活動(dòng)量，觀察口渴多飲、多食易饑、倦怠 乏力、多尿等主要臨床癥狀，按癥狀輕重積分，于試食前后統(tǒng)計(jì)積分值，并就其主要癥狀 改善（改善1分為有效），觀察臨床癥狀改善率。臨床癥狀積分表n無癥（積0分）輕癥（積1分）中癥（積2分）重癥（積3分）口渴多飲無有口渴感，飲水量2000ml/ 日多食易饑無餐前有輕度饑餓感餐前有明顯饑餓感晝夜均有饑餓感倦怠乏力無精神不振，可堅(jiān)持體力勞動(dòng)精神疲乏，勉強(qiáng)堅(jiān)持 日常工作精神極度疲乏，不 能堅(jiān)持日?；顒?dòng)多尿癥狀消失，尿量3000ml/ 日2.62.2空腹血糖觀察試食前后空腹血糖值及血糖下降

13、的百分率。2.623餐后2h血糖觀察試食前后食用100g精粉饅頭后2小時(shí)血糖值及血糖下降的百分率。2.6.3.4 尿糖用空腹晨尿定性，按一、+、+、+、+分別積0、0、5、1、2、3、4分，于試食前后統(tǒng)計(jì)積分值。2.625血脂觀察試食前后血清總膽固醇、血清甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇水平。2.7數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定凡自身對(duì)照資料可以采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組均數(shù)比較采用成組t檢驗(yàn)，后者需進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)方差齊后，用轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)；若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍不能滿足正態(tài)或方差齊的要求，改用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；方差劑但變異系數(shù)太大（如 CV50%）的資料應(yīng)用秩和檢驗(yàn)。結(jié)果判定空腹血糖結(jié)