生化分析儀常用分析方法共有三大類,分別為終點法、固定時間法和動力學(xué)法

1、生化分析儀常用分析方法共有三大類，分別為終點法、固定時間法和動力學(xué)法。終點法：指經(jīng)過一段時間的反應(yīng)，反應(yīng)達到平衡，由于反應(yīng)的平衡常數(shù)很大，可認為全部底物 （ 被測物 ） 轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物，反應(yīng)液的吸光度不再變化，只與被測物的濃度有關(guān)。這類方法通常稱為“終點”法，更確切地說應(yīng)稱“平衡”法。單試劑單波長終點法：t1 時刻加入試劑（體積為V），t2 刻加入樣本（體積為S）,然后攪拌并反應(yīng)，之后開始測量反應(yīng)液的吸光度， 在 t3 時刻反應(yīng)達到終點，t3 t2 為測定時間。反應(yīng)度R= At3At2-1 XV/(V+S),或R= At3 ARBLK其中：Ati為i時刻的吸光度，ARBL的試劑空白吸光度。單試劑雙

2、波長終點法：基本上同“單試劑單波長終點法”，只是對于每一個測定周期，其實際吸光度等于A入1 A入2。雙試劑 單 波 長 終 點 法 ： t1 時 刻 加 入第 一 試 劑 （ 體積為V1） ，t2時 刻 加入樣本（ 體 積 為 S） 之 后 立 即 攪 拌 ，t3 時 刻 加 入第二試 劑（體 積 為V2）并立即攪拌，t4 時刻反應(yīng)達到終點。t3-t2 為孵育時間,t4-t3 為測定時間。在項目參數(shù)中，如果反應(yīng)起始時間設(shè)為0,則反應(yīng)度R=A寸刻吸光度-雙試劑空白吸光度 。如果反應(yīng)起始時間小于0，則反應(yīng)度R=At4 - 雙試劑空白吸光度-t3 到 t2 間設(shè)定點的吸光度 X （ V1+S） /（

3、V1 +S+ V2）。雙試劑雙波長終點法：基本上同“雙試劑單波長終點法”，只是對于每一個測定周期，其實際吸光度等于A入1 A入2。固定時間法：又稱為一級動力學(xué)法、二點動力學(xué)法等，指在一定的反應(yīng)時間內(nèi)，反應(yīng)速度與底物濃度的一次方成正比，即v=kS 。由于底物在不斷的消耗，因此整個反應(yīng)速度在不斷的減小，表現(xiàn)為吸光度的變化越來越小。這類反應(yīng)達到平衡的時間很長，理論上可以在任意時間段進行監(jiān)測，但由于血清成份復(fù)雜，反應(yīng)剛啟動時反應(yīng)較復(fù)雜，雜反應(yīng)較多，必需經(jīng)過一段延遲時間才能進入穩(wěn)定反應(yīng)期。t1時刻加入試劑（體積為V）,之后測量試劑空白的吸光度，t2時刻加入樣本（體積為S）, t3時刻反應(yīng)穩(wěn)定，t4 時刻

4、停止對反應(yīng)進行監(jiān)測；t2 t3 為延遲時間，t3 t4 為測定時間。單波長反應(yīng)度（單雙試劑相同）：R=At4 At3雙波長反應(yīng)度：R=（ t4 時刻主波長吸光度t4 時刻次波長吸光度）- （ t3 時刻主波長吸光度t3 時刻次波長吸光度）動力學(xué)法：又稱零級動力學(xué)法，指反應(yīng)速度與底物濃度的零次方成正比，也就是與底物濃度無關(guān)。因此，在整個反應(yīng)過程中，反應(yīng)物可以勻速地生成某個產(chǎn)物，導(dǎo)致被測定溶液在某一波長下吸光度均勻地減小或增加，減小或增加的速度（AA/min）與被測物的活性或濃度成正比。動力學(xué)法也被稱為連續(xù)監(jiān)測法；主要用于酶活性的測定。實際上， 由于底物濃度不可能足夠大，隨著反應(yīng)的進行，底物消耗到

5、一定程度后，反應(yīng)速度不再為零級，因此，零級動力學(xué)法是針對于特定時間段而言的；同樣，由于血清成份復(fù)雜，反應(yīng)剛啟動時反應(yīng)較復(fù)雜，雜反應(yīng)較多，必需經(jīng)過一段延遲時間才能進入穩(wěn)定反應(yīng)期，各試劑商對這兩段時間有嚴格規(guī)定。t1時刻加入試劑（體積為V）, t2時刻加入樣本（體積為S）, t3時刻反應(yīng)穩(wěn)定，tn時刻停止對反應(yīng)進行監(jiān)測；t3-t2 為延遲時間，tn-t3 為測定時間。單波長反應(yīng)度（單雙試劑相同）R22=（n!2AT EAET） / nET- （ET）,其中：n = t3至Utn 間的數(shù)據(jù)個數(shù)，T=時間，A次一時間的吸光度。雙波長反應(yīng)度基本同單波長，只是某一時間的吸光度等于主波長吸光度減去次波長吸光

6、度。第二章 生化自動化分析方法概要一、分析方法分類（一）終點法被測物質(zhì)在反應(yīng)過程中完全被轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，即達到反應(yīng)終點，根據(jù)終點吸光度的大小求出被測物濃度，稱為終點法（end essay）。實際上被測物并沒有完全被轉(zhuǎn)變，而只是與產(chǎn)物達到一個動態(tài)的化學(xué)平衡，因此該法稱為平衡法更為恰當(dāng)。從時間- 吸光度曲線來看，到達反應(yīng)終點或平衡點時，吸光度將不再變化。分析儀通常在反應(yīng)終點附近連續(xù)選擇兩個吸光度值，求出其平均值計算結(jié)果，并可根據(jù)兩點的吸光度差來判斷反應(yīng)是否到達反應(yīng)終點。終點法參數(shù)設(shè)置簡單，反應(yīng)時間一般較長，精密度較好。終點時間的確定：根據(jù)時間-吸光度曲線來確定，如Trinder反應(yīng)測定尿酸，反應(yīng)曲線上

7、3 5min時其吸光度已趨向穩(wěn)定，因而可將 5min作為反應(yīng)終點。根據(jù)被測物反應(yīng)終點，結(jié)合 干擾物的反應(yīng)情況來確定，如在血清白蛋白的溴甲酚綠法測定中，白蛋白與溴甲酚綠在10s內(nèi)很快完成反應(yīng)，之后a球蛋白和B球蛋白與澳甲酚綠發(fā)生"慢反應(yīng)"，使反應(yīng)曲線上吸光度在10s后仍繼續(xù)緩慢上升，持續(xù)約達10min,因此終點時間應(yīng)采用1030s,而不應(yīng)選擇 10min。1一點終點法：在反應(yīng)到達終點，即在時間- 吸光度曲線上吸光度不再改變時選擇一個終點吸光度值，這種方法稱為一點終點法（one point end essay ），其反應(yīng)曲線見圖7-3。其檢測結(jié)果的計算公式是：待測物濃度 CU=

8、（待測吸光度AUk試齊IJ空白吸光度AB XK。K為校準系數(shù)，詳見第五節(jié)二操作方法。2兩點終點法：在被測物反應(yīng)或指示反應(yīng)尚未開始時，選擇第一個吸光度，在反應(yīng)到達終點或平衡時選擇第二個吸光度，此兩點吸光度之差用于計算結(jié)果，稱為兩點終點法（twopoint end essay）,其反應(yīng)曲線見圖7-4。計算公式為CU=（待測吸光度A2待測吸光度A1） x K。該法能有效地消除溶血（hemolysis ）、黃疸（icterus ）和脂濁（lipo-turbid ）等 樣品本身光吸收（見圖7-5 ）造成的干擾。在單試劑分析加入試劑的初期、或雙試劑分析中第二試劑加入之初，若指示反應(yīng)吸光度尚未明顯變化，則可

9、在此時選擇第一個吸光度，在指示反應(yīng)終點時選擇第二個吸光度，從而設(shè)置成兩點終點法。但指示反應(yīng)初期吸光度無明顯變化的化學(xué)反應(yīng)較少，如單試劑方式測定總蛋白、白蛋白、鈣、磷、鎂等的終點法分析項目，及雙試劑方式測定葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯等的終點法分析項目，因反應(yīng)初期吸光度已有明顯變化，因而均難以用上述方式設(shè)置兩點終點法。但在雙試劑分析中，如果將第一吸光度選擇在第二試劑加入前，此時指示反應(yīng)一般尚未開始，則能容易設(shè)置兩點終點法。在此要注意必須將兩次讀吸光度時不同比色液體積進行校正。目前全自動分析儀均 具有此自動校正功能，不必手工進行校正。（二）固定時間法指在時間 -吸光度曲線上選擇兩個測光點，此兩點既非

10、反應(yīng)初始吸光度亦非終點吸光度，這兩點的吸光度差值用于結(jié)果計算，稱為固定時間法（fixed-time essay ），反應(yīng)曲線見圖7-6。其計算公式與兩點終點法相同，為 CU=（A2-A1）XK。有時也稱此法為兩點法。該分析方法有助于解決某些反應(yīng)的非特異性問題。例如：苦味酸法測定肌酐，反應(yīng)的最初30s內(nèi)，血清中快反應(yīng)干擾物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能與堿性苦味酸反應(yīng)；在 第二個30s時堿性苦味酸主要與肌酊反應(yīng)，且此段時間-吸光度曲線的線性較好（故也可用 連續(xù)監(jiān)測法測定肌酊）；在80120s及其以后，堿性苦味可與蛋白質(zhì)以及其它慢反應(yīng)干擾 物反應(yīng)。這樣選用反應(yīng)的第二個30s為測定時間，既避免了

11、快反應(yīng)物質(zhì)的干擾，也避免了慢 反應(yīng)物質(zhì)的影響，使肌酐濃度與吸光度變化呈良好的線性關(guān)系，有利于提高分析的特異性 和準確度。（三）連續(xù)監(jiān)測法連續(xù)監(jiān)測法（continuous monitoring essay ）又稱速率法（rate essay ），是在測定酶活性或用酶法測定代謝產(chǎn)物時，連續(xù)選取時間- 吸光度曲線中線性期的吸光度值，并以此線性期的單位吸光度變化值（A A/min）計算結(jié)果，見圖7-7A和B。所謂線性期就是各點吸光度 差值相等，如圖7-7C所示，圖中6 1及6 5值偏小，而6 2= 6 3= 6 4,故A1點至人4點屬線性 段。此線性期對底物來說屬零級反應(yīng)，期間的AA/min即為酶促反

12、應(yīng)的初速度，其大小與被測酶活性成正比。連續(xù)監(jiān)測法的優(yōu)點即是可以確定線性期并計算AA/min,根據(jù)此值再準確地計算酶活性，因而使自動生化分析儀在酶活性測定方面顯著地優(yōu)于手工法。連續(xù)監(jiān)測法也可用于測定呈線性反應(yīng)的代謝物濃度，一般是某些基于酶法測定的代謝物。酶活性 （ U/L）=A A/min X理論（或校準）Kfi,代謝物濃度CU也A/min X校準Kfi。關(guān)于理論Kfi和校準K 值敘述如下：1 .理論Kfi :多用于酶活性測定中，因酶活性尚無公認的校準品可用，因而根據(jù)酶 活性的國際單位定義得出酶活性的計算公式為：酶活性（U/L尸A A/min X ,將此式中 以K來表示，此K值可通過對已知值即指

13、示物質(zhì)的毫摩爾消光系數(shù)（e）、反應(yīng)液總?cè)萘浚═V）、樣品容量（SW和比色杯光徑（d）計算后得出，即為理論Kfi,可作為分析參數(shù)輸入到分 析儀中。采用理論Kfi的前提應(yīng)當(dāng)是樣品和試劑的加量準確、比色杯光徑準確、溫度控制精確以及波長準確等。但事實上由于各型分析儀在注射器容積步進電機精度、濾光片帶寬等方面的差異，可造成樣品和試劑加量以及吸光度檢測的偏差。溫度的影響有時也非常大，由于反應(yīng)盤是半暴露的，因此隨著較冷試劑的加入，反應(yīng)盤中的溫度會逐漸降低，盡管開始測定時反應(yīng)盤溫度已升到37。C,但在某一項目測定過程的開始階段，溫度可能達不到37。C，甚至僅35° C左右，且反應(yīng)過程中仍有可能上下波

14、動，這對于酶學(xué)反應(yīng)來說影響是很大的。如 采用37° C寸的理論K值，將會使測定結(jié)果降低，溫度的波動還會使得結(jié)果的重復(fù)性降低。當(dāng)然，若試劑在加入反應(yīng)杯前經(jīng)試劑臂內(nèi)加熱裝置預(yù)溫，則基本不影響反應(yīng)盤溫度。由于摩爾吸光系數(shù)受比色杯光徑、波長、帶寬以及加樣系統(tǒng)的準確性等的影響，書本上或試劑廠家提供的理論摩爾吸光系數(shù)可能與實際所用分析儀所測的不同，因而有必要獲得實際的摩爾吸光系數(shù)，然后用來計算的K值稱為實測K值。(1) NADHNADPH摩爾吸光系數(shù)的測定：NADH(NADPH沒有標準純制品，而且配成溶液 后穩(wěn)定性又較差，不能直接用NADH或NADPH準液來校正儀器，須通過有NAD+(NADP簪

15、與 的反應(yīng)途徑。用已糖激酶(HK)或葡萄糖脫氫酶(GD)方法測定葡萄糖時，葡萄糖的消耗與 NADH6生成呈等摩爾關(guān)系。葡萄糖有標準純制品，又有國家批準文號的葡葡糖標準液。因 此，根據(jù)公式A=e bC,已知比色杯光徑b和葡萄糖標準液濃度，測得葡萄糖標準管的吸光度 A后便可計算出NADH(NADPH的摩爾吸光系數(shù)e為A/bC。假設(shè)，葡萄糖標準液濃度為1Ommo1/L(0.01mol/L),標準液加入量為3.5仙L,酶試劑加入量為335 L,比色杯光徑為 0.7cm,在340nmM得吸光度為0.465,則實測NAD摩爾吸光系數(shù)=6424 ,即在此臺分析 儀上340nn長處測得NADH( NADPH的

16、摩爾吸光系數(shù)為6424,而理論上NADH NADPH的e 為 6220。(2)"色素原"酶促產(chǎn)物在405nn長摩爾吸光系數(shù)的測定：有許多酶底物為人工合成的"色素原"底物，其本身無色，經(jīng)酶作用后釋放出有色的反應(yīng)產(chǎn)物，在405nmfe長具有吸收峰。最常用色素原底物及其產(chǎn)物為: ALP 測定以磷酸對硝基苯酚(4-Nitrophenyl phosphate ，4-NPP)為底物，經(jīng)酶作用后釋放出黃色的對硝基苯酚(4-Nitrophenol , 4-NP), GGTJ定以Y -L-谷氨酰對硝基苯胺(y -L-Glutamyl-p-nitroanilide) 或丫

17、-L-谷氨酰-3-羥基-對硝基 苯胺(丫 -L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)為底物，經(jīng)酶作用后釋放出黃色的對硝基苯月5(p-Nitroaniline, 4-NA)或?qū)ο趸?5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid , ANBA)。對硝基苯酚的摩爾吸光系數(shù)為18700(405nm),對硝基苯胺的摩爾吸光系數(shù)為 9870(405nm), 對硝基-5-氨基苯甲酸的摩爾吸光系數(shù)為9490(405nm)。下面是對硝基苯酚的摩爾吸光系數(shù) 測定方法。試劑： 4-NPfe準儲存液(1Ommo1/L)o 4-NPfe準應(yīng)用液(2.5mmo1/L ,以 0.

18、84mol/L AMP 緩沖液稀釋而成)。底物緩沖液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL緩沖液中， 37 ,pH l0.09 土 0.02) 。測定方法：4-NPfe準液加入量為5L,底物緩沖液加入量為350仙L,波長405nm光徑0.7cm, 溫度37C,測定得吸光度為A1;另用蒸儲水代替4-NPfe準液，按上述方法測定其吸光度為 A2, 4-NPfe準液吸光度A A= A1- A2 ,若測得A AJ 0.460,則實測4-NP摩爾吸光系數(shù)= =186622.校準Kfi 酶活性校準品經(jīng)校準操作后由分析儀自動計算得出。在進行酶學(xué)測定時，如果分析條件的變化如溫度、

19、樣品試劑加量和吸光度檢測偏差可同等程度地影響校準物和待測樣品，則使用校準品能進行補償。一般來說以使用校準Kffi為好，但必須有兩個先決條件： 必須使用配套的試劑；必須使用配套的高質(zhì)量的校準品，該校準品應(yīng)具有溯源性。使 用與該分析儀配套的酶活性校準品也可得到較好的酶活性測定結(jié)果。關(guān)于酶活性標準品，歐洲標準局(BCR和美國國家標準技術(shù)研究院(NIST)均發(fā)表了人血清基質(zhì)的酶活性標準 物，但目前尚無公認的標準(校準)品問世。(四)透射比濁法抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合形成的免疫復(fù)合物，在反應(yīng)液中具有一定的濁度，可由一般分光光度法進行透射比濁（transmission turbidimetry ）測定，可用于

20、某些蛋白質(zhì)和藥物濃度等的測定。該法須做多點校準，再經(jīng)非線性回歸，求出抗原或抗體的含量。使用散射比濁法（ scatter turbidimetry ）能更加準確快速地檢測抗原抗體形成濁度的大小或其速度，目前專用的特定蛋白分析儀可做此法檢測。有關(guān)免疫比濁法原理詳見第二章。二、常用生化檢測項目分析方法舉例1終點法檢測常用的有總膽紅素（氧化法或重氮法）、結(jié)合膽紅素（氧化法或重氮法）、血清總蛋白（雙縮脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、總膽汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、總膽固醇（膽固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白膽固醇（直接測定法）、鈣（偶氮種出法）

21、、磷（紫外法）、鎂（二甲苯胺藍法）等。以上項目中，除鈣、磷和鎂基本上還使用單試劑方式分析因而采用一點終點法外，其它測定項目都可使用雙試劑故能選用兩點終點法，包括總蛋白、白蛋白測定均已有雙試劑可用。2固定時間法苦味酸法測定肌酐采用此法。3連續(xù)監(jiān)測法對于酶活性測定一般應(yīng)選用連續(xù)監(jiān)測法，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、丫谷氨氨?；D(zhuǎn)移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。 一些代謝物酶法測定的項目如己糖激酶法測定葡萄糖、脲酶偶聯(lián)法測定尿素等，也可用連續(xù)監(jiān)測法。4透射比濁法透射比濁法可用于測定產(chǎn)生濁度反應(yīng)的項目，多數(shù)屬免疫比濁法，載脂蛋白、免疫球蛋白、補體、抗"O"

22、;、類風(fēng)濕因子，以及血清中的其他蛋白質(zhì)如前白蛋白、結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等均可用此法。第三章常用生化檢測項目分析方法舉例及參數(shù)設(shè)置一、常用生化檢測項目分析方法舉例1終點法檢測常用的有總膽紅素（氧化法或重氮法）、結(jié)合膽紅素（氧化法或重氮法）、血清總蛋白（雙縮脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、總膽汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、總膽固醇（膽固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白膽固醇（直接測定法）、鈣（偶氮種出法）、磷（紫外法）、鎂（二甲苯胺藍法）等。以上項目中，除鈣、磷和鎂基本上還使用單試劑方式分析因而采用一點終點法外，其它測定項目都可使用雙試劑故能

23、選用兩點終點法，包括總蛋白、白蛋白測定均已有雙試劑可用。2固定時間法苦味酸法測定肌酐采用此法。3連續(xù)監(jiān)測法對于酶活性測定一般應(yīng)選用連續(xù)監(jiān)測法，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、丫谷氨氨?；D(zhuǎn)移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。 一些代謝物酶法測定的項目如己糖激酶法測定葡萄糖、脲酶偶聯(lián)法測定尿素等，也可用連續(xù)監(jiān)測法。4透射比濁法透射比濁法可用于測定產(chǎn)生濁度反應(yīng)的項目，多數(shù)屬免疫比濁法，載脂蛋白、免疫球蛋白、補體、抗"O"、類風(fēng)濕因子，以及血清中的其他蛋白質(zhì)如前白蛋白、結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等均可用此法。二、分析參數(shù)設(shè)置分析儀的一些通用操作步驟如取樣、沖洗、吸

24、光度檢測、數(shù)據(jù)處理等，其程序均已經(jīng)固化在存儲器里，用戶不能修改。各種測定項目的分析參數(shù)( analysis paramete)大部分也已設(shè)計好，存于磁盤中，供用戶使用；目前大多數(shù)生化分析儀為開放式，用戶可以更改這些參數(shù)。生化分析儀一般另外留一些檢測項目的空白通道，由用戶自己設(shè)定分析參數(shù)。因此必須理解各參數(shù)的確切意義。一、分析參數(shù)介紹(一)必選分析參數(shù)這類參數(shù)是分析儀檢測的前提條件，沒有這些參數(shù)無法進行檢測。1 試驗名稱試驗名稱 ( test code) 是指測定項目的標示符，常以項目的英文縮寫來表示。2 .方法類型(也稱反應(yīng)模式)方法類型(assay)有終點法、兩點法、連續(xù)監(jiān)測法等，根據(jù)被檢物

25、質(zhì)的檢測方法原理選擇其中一種反應(yīng)類型。3反應(yīng)溫度一般有30、37可供選擇，通常固定為37。4主波長主波長(primary wavelength )是指定一個與被測物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物的光吸收有關(guān)的波長。5次波長次波長(secondary wavelength )是在使用雙波長時，要指定一個與主波長、干擾物質(zhì)光吸收有關(guān)的波長。6反應(yīng)方向反應(yīng)方向(response direction )有正向反應(yīng)和負向反應(yīng)兩種，吸光度增加為正向反應(yīng)，吸光度下降為負向反應(yīng)。7. 樣品量 樣品量(sampling volum ) 一般是2膜35仙l ,以0.1履步進，個別分析儀最 少能達到1.6屋。可設(shè)置常量、減量和增量。8

26、. 第一試劑量 第一試劑量(first regengt volum ) 一般是20300仙l ,以1川步進。9. 第二試劑量 第二試劑量(second regengt volum) 一般也是20300仙l ,以1川 步進。10總反應(yīng)容量總反應(yīng)容量(total reacting volum )在不同的分析儀有一個不同的規(guī)定范圍，一般是180350仙l,個別儀器能減少至120仙l?？偡磻?yīng)容量太少無法進行吸光度測定。11孵育時間孵育時間(incubate time )在終點法是樣品與試劑混勻開始至反應(yīng)終點為止的時間，在兩點法是第一個吸光度選擇點開始至第二個吸光度選擇點為止的時間。12延遲時間延遲時間

27、(delay time )在連續(xù)監(jiān)測法中樣品與反應(yīng)試劑(第二試劑)混勻開始至連續(xù)監(jiān)測期第一個吸光度選擇點之間的時間。13 連續(xù)監(jiān)測時間連續(xù)監(jiān)測時間( continuous monitoring time) 在延遲時間之后即開始，一般為60120s,不少于4個吸光度檢測點(3個吸光度變化值)。14 校 準 液 個 數(shù) 及 濃 度 校 準 曲 線 線 性 好 并 通 過 坐 標 零 點 的 ， 可 采 用 一 個 校 準 液( calibrator )；線性好但不通過坐標零點，應(yīng)使用兩個校準液；對于校準曲線呈非線性者，必須使用兩個以上校準液。每一個校準液都要有一個合適的濃度。15 .校準Kfi或理

28、論Kfi通過校準得到的Kfi為校準Kfi ( calibrate coefficient )或由計 算得出的K值為理論Kfi。16線性范圍即方法的線性范圍（linearity range ），超過此范圍應(yīng)增加樣品量或減少樣品量重測。與試劑/ 樣品比值有關(guān)。17小數(shù)點位數(shù)檢測結(jié)果的小數(shù)點位數(shù)（decimal point digit ）。（二）備選分析參數(shù)這類分析參數(shù)與檢測結(jié)果的準確性有關(guān)，一般來說不設(shè)置這類分析參數(shù)，分析儀也能檢測出結(jié)果，但若樣品中待測物濃度太高等，檢測結(jié)果可能不準確。1樣品預(yù)稀釋設(shè)置樣品量、稀釋劑量和稀釋后樣品量三個數(shù)值，便可在分析前自動對樣品進行高倍稀釋。2底物耗盡值底物耗盡

29、值（substrate exhaust limit ）在負反應(yīng)的酶活性測定中，可設(shè)置此參數(shù)，以規(guī)定一個吸光度下降限。若低于此限時底物已太少，不足以維持零級反應(yīng)而導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確。3前區(qū)檢查免疫比濁法中應(yīng)用，以判斷是否有抗原過剩。將終點法最后兩個吸光度值的差別（A A）設(shè)置一個限值，如果后一點的吸光度比前一點低，表示已有抗原過剩，應(yīng)稀釋樣品后重測。4試劑空白吸光度范圍超過此設(shè)定范圍表示試劑已變質(zhì)，應(yīng)更換合格試劑。5試劑空白速率連續(xù)監(jiān)測法中使用，是試劑本身在監(jiān)測過程中沒有化學(xué)反應(yīng)時的變化速率。16 方法學(xué)補償系數(shù)用于校準不同分析方法間測定結(jié)果的一致性，有斜率和截距兩個參數(shù)。7參考值范圍對超過此范

30、圍的測定結(jié)果，儀器會打印出提示。（三）某些參數(shù)的特殊意義1最小樣品量最小樣品量是指分析儀進樣針能在規(guī)定的誤差范圍內(nèi)吸取的最小樣品量。一般分析儀的最小樣品量是2小，目前也有小至1.6履的。在樣品含高濃度代謝產(chǎn)物或高活性酶濃度的情況下往往需采用分析儀的最小樣品量作為減量參數(shù)，從而使分析儀檢測范圍（與線性范圍不同）的上限得以擴大。2最大試劑量方法靈敏度很高而線性上限低的檢測項目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法測定，以往手工法操作時樣品量10小，試劑量4ml,這樣試劑量/樣品量比例（R/S）為200, 線性上BM則為60g/L。此法移植到分析儀上后，R/S卻很難達到200,致使線性上限變低。因 此對這類檢測

31、項目最大試劑量非常重要。3彈性速率在酶活性測定中，當(dāng)酶活性太高，在連續(xù)監(jiān)測期中已不呈線性反應(yīng)時，有些儀器具有彈性速率（flexrate ）功能，能自動選擇反應(yīng)曲線上連續(xù)監(jiān)測期中仍呈線性的吸光度數(shù)據(jù)計算結(jié)果，使酶活性測定的線性范圍得以擴大。如ASTT從1000U/L擴展至4000U/L, 從而減少稀釋及重測次數(shù)、降低成本。4試劑空白速率當(dāng)樣品中存在膽紅素時，膽紅素對堿性苦味酸速率法或兩點法測定肌酐有負干擾。因為膽紅素在肌酊檢測的波長 505nmt較高光吸收，而且膽紅素在堿性環(huán)境中可被氧化轉(zhuǎn)變，因而在肌酐反應(yīng)過程中膽紅素的光吸收呈下降趨勢。若在加入第一試劑后一段時間內(nèi)設(shè)置試劑空白速率，因為此段中苦

32、味酸尚未與肌酐反應(yīng)，而膽紅素在第一試劑的堿性環(huán)境中已同樣被氧化轉(zhuǎn)變，因而以第二試劑加入后的速率變化，減去試劑空白速率變化，便可消除膽紅素的負干擾，見圖7-8。二、單波長和雙波長方式（一）概念采用一個波長檢測物質(zhì)的光吸收強度的方式稱為單波長（mono-wavelength） 方式。當(dāng)反應(yīng)液中含有一種組分，或在混合反應(yīng)液中待測組分的吸收峰與其它共存物質(zhì)的吸收波長無重疊時，可以選用。在吸光度檢測中，使用一個主波長和一個次波長的稱雙波長方式。當(dāng)反應(yīng)液中存在干擾物的較大吸收、從而影響測定結(jié)果的準確性時，采用雙波長方式更好。（二）雙波長的作用雙波長 （di-wavelength） 測定優(yōu)點是消除噪音干擾;

33、 減少雜散光影響; 減少樣品本身光吸收的干擾。從光源，到比色杯、單色器、檢測器的整個光路系統(tǒng)中，均存在著隨時間發(fā)生變化的不穩(wěn)定的檢測信號，即噪音，而雙波長檢測是同時進行的，兩種波長檢測產(chǎn)生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干擾。當(dāng)樣品中存在非化學(xué)反應(yīng)的干擾物如甘油三酯、血紅蛋白、膽紅素等時，會產(chǎn)生非特異性的光吸收，而干擾測定結(jié)果的準確性。采用雙波長方式測定可以部分消除這類干擾，提高檢測的準確性。（三）次波長的確定方法當(dāng)被測物的主波長確定之后，再選擇次波長。如根據(jù)甘油三酯等干擾物吸收光譜特征，選擇次波長，使干擾物在主、次波長處有盡可能相同的光吸收值，而被測物在主、次波長處的光吸收值應(yīng)有較大的差異。

34、一般來說，次波長應(yīng)大于主波長100nm以主波長與次波長吸光度差來計算結(jié)果。（四）雙波長的具體應(yīng)用對于某些反應(yīng)速度快且無法設(shè)置為兩點終點法的分析項目，尤其是單試劑分析中，可以利用雙波長的方式來部分消除樣品本身的光吸收干擾。目前用單試劑法測定的項目應(yīng)用雙波長的為血清總蛋白（雙縮月尿法）主波長 500nm次波長576nm血清白蛋白（澳甲酚氯法）主、次波長分別為600和700nm鈣（偶氮種田法）主、次波長分別為 660、770nm磷（紫 外比色法）主、次波長為340、405nmi鎂（二甲苯胺藍法）主、次波長為 505和600nm。三、單試劑和雙試劑方式反應(yīng)過程中只加一次試劑稱單試劑方式，加兩次試劑便為

35、雙試劑方式。目前的生化分析儀大多可用雙試劑方式分析，其優(yōu)點是：可提高試劑的穩(wěn)定性，多數(shù)雙試劑混合成單一工 作試劑時，其穩(wěn)定時間縮短；能設(shè)置兩點終點法，來消除來自樣品本身的光吸收干擾； 在某些項目檢測時能消除非特異性化學(xué)反應(yīng)的干擾。如血清ALTM定，血清中的內(nèi)源性內(nèi)酮酸及其它酮酸也可與試劑中的指示酶（乳酸脫氫酶）起反應(yīng)，使結(jié)果偏高。若先加入缺乏a -酮戊二酸的第一試劑，使其它酮酸與指示酶反應(yīng)之后再加入含有a-酮戊二酸的第二試劑，啟動真正的ALT!促反應(yīng)生成丙酮酸，而丙酮酸與乳酸脫氫酶的反應(yīng)消耗的 NAt能真正反映ALT勺活性，從而消除以上副反應(yīng)的影響。四、測定過程的自動監(jiān)測各種自動生化分析儀或多

36、或少都具有對測定過程進行各種監(jiān)測的功能，以便在沒有人"監(jiān)督" 化學(xué)反應(yīng)的情況下提高檢測的準確性。高檔分析儀的監(jiān)測功能更強。1試劑空白監(jiān)測每種試劑都有一定的空白吸光度范圍，試劑空白吸光度的改變往往提示著該試劑的變質(zhì)：如利用Trinder 反應(yīng)為原理的檢測試劑會因酚被氧化為醌而變?yōu)榧t色；堿性磷酸酶、T -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、淀粉酶等檢測試劑會因基質(zhì)分解出硝基酚或硝基苯胺而變黃；有些試劑久置后變渾濁。這些情況均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等負反應(yīng)檢測項目，其t劑在放置過程中空白吸光度會因NADH行氧化為NAD+5下降等。試劑空白的測定方法有兩種：每瓶試劑在使

37、用前通過對試劑空白校準來確定試劑空白吸 光度，這種方式適用于先取樣品后加試劑的分析儀。每個樣品測定前均檢測試劑空白吸 光度，適用于先加試劑后取樣品的分析儀。2試劑空白變化速率監(jiān)測一些酶試劑在反應(yīng)溫度下不穩(wěn)定，其空白吸光度可隨著時間逐漸發(fā)生變化，這種變化的主要原因與工具酶或輔酶的純度有關(guān)，且因試劑的組成和生產(chǎn)廠家的不同而不同。這種變化會影響測定結(jié)果的準確性，一般使結(jié)果偏高。如果設(shè)置此項監(jiān)測，分析儀在結(jié)果計算時會自動減去試劑空白變化速率。在以監(jiān)測NAD(P) H減少為指示反應(yīng)的酶活性測定中，空白速率可監(jiān)測并消除由NADH身氧化所造成的吸光度下降；在色素原為底物的酶活性測定中，空白速率可監(jiān)測并消除底

38、物自身分解造成的吸光度升高。有關(guān)空白速率監(jiān)測在膽紅素對堿性苦味酸速率法測定肌酐負干擾消除中的作用，已如前述。3樣品信息監(jiān)測由于樣品的溶血、脂濁、黃疸會對測定結(jié)果產(chǎn)生非化學(xué)反應(yīng)的干擾。根據(jù)溶血、脂濁、黃疸的光譜吸收特性，用雙波長或多波長檢測其性質(zhì)和程度，一般是測定樣品在600nm570nm 700nm/660nmf口505nm/480nr®光度比值的大小來分別判斷樣品溶血、脂濁和黃疸程度。然后在結(jié)果計算時自動減去這部分干擾，這將有利于提高分析結(jié)果的可 靠性。4結(jié)果可靠性監(jiān)測( 1)終點監(jiān)測：終點法測定要判斷所選的測光點是否到達終點或平衡點。一些分析儀在所選終點后再選一個測光點，比較這兩

39、點吸光度的差異來判斷反應(yīng)是否到達終點。( 2)線性期監(jiān)測：連續(xù)監(jiān)測法選擇時間吸光度反應(yīng)曲線上的線性期來計算酶活性或被測物濃度，因此儀器要確定此連續(xù)監(jiān)測期是否呈線性。具監(jiān)測方法為將連續(xù)監(jiān)測到的各吸光度值進行線性回歸，計算出各點的方差，根據(jù)方差值的大小來判斷是否呈線性；取連 續(xù)監(jiān)測期開始若干點的變化速率與連續(xù)監(jiān)測期最后若干點的變化速率進行比較，來判斷是否為線性期。5底物消耗的監(jiān)測在連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性時，如果在監(jiān)測期內(nèi)吸光度上升或下降超過其底物耗盡值，則說明該樣品酶活性非常高，底物將被耗盡，監(jiān)測期的吸光度將偏離線性，使測定結(jié)果不可靠。此時不打印結(jié)果或打印結(jié)果同時也打印出底物耗盡提示，該樣品應(yīng)稀釋一

40、定的倍數(shù)重新測定。此監(jiān)測對于采用負反應(yīng)分析酶活性的方法甚為重要。見圖7-96方法線性范圍監(jiān)測每種待測物分析都有一個可測定的濃度或活性范圍，樣品結(jié)果若超過此范圍，分析儀將顯示測定結(jié)果超過線性范圍的提示，多數(shù)分析儀會自動將樣品減量或增量重新測定。第四章標準品和校準品傳統(tǒng)的臨床檢驗，要使檢驗結(jié)果可靠或有依據(jù)，往往有一個標準品(Standard) 。以臨床化學(xué)檢驗的比色測定為例，常作三個檢測：空白、標準、測定。用空白液調(diào)整吸光度為零，讀出測定比色液和標準比色液的吸光度，分別為As和Au;已知標準液濃度為Cso在一定范圍內(nèi)，某分析物濃度和吸光度呈良好比例關(guān)系。為了克服純標準液和病人樣品間的基體差異，20

41、年前開始引用具有與病人樣品基體相似的校準品替代標準品，用于日常工作。由于以往在使用標準品時不強調(diào)它的專用性，國內(nèi)在應(yīng)用校準品時忽略了它的專用性。任何方法或儀器、試劑使用一個校準品，嚴重影響檢驗質(zhì)量。一、標準液的定值一般而言，檢驗工作使用的標準品屬應(yīng)用標準。配制或供應(yīng)這類標準品的實驗室或廠商具有符合質(zhì)量標準的純品。稱取一定量的純品，然后將其溶解，在容量瓶內(nèi)用溶劑稀釋至容積刻度，混勻，標準液配制完成。由稱量法獲得的稱量值和容量法配制的容積，計算出該標準品濃度。檢定部門抽樣測定，結(jié)果在規(guī)定范圍內(nèi)屬合格。即使測定檢定結(jié)果在范圍的上、下限，也不能將實測值作為標準值。因為測定值的可靠性取決于檢定方法，一般

42、的分析方法的可靠性不如分析化學(xué)公認的稱量法和容量法。所以標準品的定值由稱量和容積計算確定。檢定不合格即報廢，決不可將實測值替代修正。二、校準品的定值1校準值隨方法而異如前述，由于純標準液和新鮮病人標本間的基體差異，以標準液標化常用方法后，常用方法檢測病人標本的結(jié)果和參考方法結(jié)果的可比性很差。為了克服基體效應(yīng)，推薦使用校準品。校準品的大多來源為人的樣品混合物，如混合血清。本身內(nèi)含被檢分析物，制備時可添加某些分析物增加含量。校準品中被檢分析物的含量無法由稱量法和容量法確定，只能倚賴于分析方法。校準品的校準值必須取決于分析方法或檢測系列。2新鮮病人標本是最佳校準品由于所有校準品都是處理過的樣品，和新

43、鮮病人標本有著基體差異。若使用公認的參考方法去標化測定校準品，測定程序是嚴密的，測定值是可靠的。但使用該測定值去校準常規(guī)的檢測系列時，校準品中被檢分析物參與反應(yīng)時的表現(xiàn)明顯不同于新鮮病人標本，不能將參考方法系列的準確度通過校準品傳遞給病人標本。須明確的，所有用于檢驗中的檢測方法、 儀器、 試劑等都是用來檢測病人新鮮標本的，不是用來檢測校準品這樣的處理過樣品。如果先用公認的參考方法檢測病人標本，再以具有參考值的病人標本去校準某檢測系列（包括方法、試劑、儀器），此時該檢測系列再檢測其他新鮮病人標本時，這些病人標本結(jié)果的溯源性可上溯至公認的參考方法。也即用新鮮病人標本是校準檢測系列的最佳校準品。用這

44、種方式校準，能使同一個檢測系列在不同實驗室檢測新鮮病人標本時，檢驗結(jié)果在實驗室間具可比性。一些大公司正是按照這樣的認識為校準品定值。三 、原則上，以具有參考值的新鮮病人標本去校準某檢測系列（包括方法、試劑、儀器）后，檢測系列再去檢測候選的校準品（處理過），得到的檢測值為初始校準值。以初始校準值反過來再校準組合的檢測系列后，該檢測系列又去檢測病人的新鮮標本。觀察病人標本的檢測值是否和參考方法的測定值具良好的可比性。實踐說明，只有不斷地調(diào)整校準值，直至用該校準值校準指定的檢測系列（加上具有校準值的校準品，即組合成檢測系統(tǒng)）后，檢測系統(tǒng)再檢測病人標本，得到的測定值和病人標本的參考方法測定值具有滿意的

45、可比性（測定值和參考值間的偏倚0 2%。此時，校準品的校準值可以確認。1校準值不是測定值，是糾正的調(diào)整值（Corrected Value）廠商的校準品定值方案極為嚴密。為了便于說明問題，以某公司的定值方案為例，定值的校準品是人血清。1）準備一批血清樣品，內(nèi)含被檢分析物含量不同，可反映所需的病人結(jié)果可報告范圍。將它們離心、過濾， 分裝后深低溫保存。由參考實驗室用公認的參考方法和標準品或參考品，對這些血清檢測定值。這些血清是公司的一級“參考品”，參考方法對血清的定值猶如參考值，是確定校準品校準值的依據(jù)。2）制備一大批侯選校準品。由參考實驗室也為之定值。邀請多家具有指定的相同型號儀器的實驗室（包括公

46、司的實驗室）參與工作。指定使用公司某型號的試劑盒（批號任意）及檢測程序。校準目標是：公司提供的儀器、試劑和方法系列（加上校準品即為檢測系統(tǒng)）對病人樣品的檢測結(jié)果和參考方法對病人樣品檢測結(jié)果具可比性。首先，用侯選校準品的定值對檢測系列校準后，檢測一級參考品的血清。由于侯選校準品和病人樣品間的基體差 異，以它的參考實驗室定值對檢測系統(tǒng)校準后，檢測系統(tǒng)對病人樣品的檢測結(jié)果必然和這 些血清已有的參考值有偏倚。要使組成的檢測系統(tǒng)實現(xiàn)校準目標，唯一方法是調(diào)整侯選校 準品的校準值。經(jīng)反復(fù)檢測和調(diào)整、統(tǒng)計，最終實現(xiàn)校準目標時的校準值，為該校準品的 定值。這個校準品是公司的一級校準品，是公司內(nèi)部具有可溯源性的第

47、一代的校準品，不 外售。3）以后公司在生產(chǎn)供應(yīng)給客戶的校準品時，生產(chǎn)質(zhì)量規(guī)格相同于一級校準品，定值方案也相同于上述步驟；但此時分發(fā)給各實驗室的一級校準品已具有了真正校準該檢測系統(tǒng)的校 準值。各實驗室的檢測系統(tǒng)被一級校準品校準后，檢測一級參考品血清和新校準品。首先 確認各系統(tǒng)對一級參考品血清檢測結(jié)果和原有的血清參考值具良好的可比性，說明一級校 準品有效。再以新校準品的定值去校準各系統(tǒng)后，各系統(tǒng)再檢測一級參考品血清和一級校準品，觀察檢測結(jié)果。若能實現(xiàn)校準目標，校準確認，則新校準品的定值為它的校準值。在實踐中血清結(jié)果往往仍然出現(xiàn)偏倚，必須對新校準品的定值略作調(diào)整，反復(fù)檢測，直至 實現(xiàn)校準目標，調(diào)整的

48、最佳值為該批校準品的校準值。此時這批校準品可供市售。4）為使公司供應(yīng)的各批校準品間具可比性，以后對每批新校準品定值時，須使用已上市的校準品、即將過期的校準品、以及即將上市的校準品當(dāng)作控制品，隨同一級校準品和一級 參考品血清一起被檢測。它們的檢測結(jié)果須和原校準值的偏倚小于某規(guī)定的范圍（如不大于 2%），方可認可這批校準品的校準值（這即為校準認可的要求）。5）用這樣的程序制備的校準品，專用于指定的某公司型號的儀器、試劑、方法和檢測程序組成的檢測系統(tǒng)。因此校準品只能為這樣的系統(tǒng)服務(wù)，起校準作用，不能對其他系統(tǒng)作校 準。2具多個校準值的校準品專門供應(yīng)試劑盒的廠商，為了使他們的試劑盒用于各種類型、型號的

49、儀器和方法，也同時 為客戶提供校準品。說明書告訴客戶，使用他們的校準品，按公司指定校準您原系統(tǒng)的校 準值去校準系統(tǒng)，可以使新組合的檢測系統(tǒng)（原儀器、方法、檢測程序，新試劑和新校準 品）的病人標本檢測結(jié)果和原配套檢測系統(tǒng)的病人標本檢測結(jié)果具可比性。由于各公司的原檢測系統(tǒng)，從試劑、校準品、儀器都有各自特點，形成了各檢測系統(tǒng)間的差異。而這類 試劑廠商專門針對客戶不同檢測系統(tǒng)，在替用他們的試劑時強調(diào)了替換后必須用他們的校準品，而且必須按校準品說明書上原系統(tǒng)名稱下指定的校準值校準新系統(tǒng)，可使新系統(tǒng)對 病人樣品的檢測結(jié)果和原系統(tǒng)結(jié)果具可比性。同一個校準品適用于不同系統(tǒng)必須有不同的 校準值，這樣的做法充分說明校準值的專用特性。決不能一個校準品、一個校準值、一種試劑盒用于各種不同的儀器；也不能一個校準品、一個校準值，用于不同的、已具有原試劑配套的儀器系列；無論哪一種方式均使病人樣品的檢測結(jié)果不可靠，也不具有溯源性。第五章質(zhì)控品 標準品 校準品校準品、標準品、質(zhì)控品三者同為參考物質(zhì)。參考物質(zhì)是一種材料或者物質(zhì)，某一種或多 種特性值只夠均勻并被良好確定，用于