大鼠急性肝損傷中一氧化氮及自由基的變化

1、    大鼠急性肝損傷中一氧化氮及自由基的變化        用TAA誘發(fā)大鼠急性肝損傷，觀察肝損傷大鼠內(nèi)NO與自由基的產(chǎn)生及其對(duì)肝損傷的影響。材料與方法一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar大鼠，雄性，體重200300克。二、主要藥品：TAA、L-Arg、L-NNA、鱟試劑盒、ALT與AST試劑盒三、實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)(一) 急性肝損傷大鼠NO產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)觀察：大鼠24只，隨機(jī)平均分為四組，一組為正常組，其余三組為肝損傷組。肝損傷組動(dòng)物皮下注射單劑量TAA600mg/kg，24小時(shí)、48小時(shí)

2、、72小時(shí)各取動(dòng)物六只，乙醚麻醉下腹主動(dòng)脈采血，測(cè)定內(nèi)毒素含量及NO穩(wěn)定終產(chǎn)物硝酸鹽/亞硝酸鹽(NO3-/NO2-)含量。測(cè)定ALT、AST。取肝右葉凍存于-70，兩周內(nèi)制備肝組織勻漿，測(cè)定蛋白含量、脂質(zhì)過(guò)氧化物岐化酶(SOD)活性，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPX)活性。另取肝右中葉組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，6mm切片，做HE染色，觀察肝組織學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)(二) NO對(duì)大鼠急性肝損傷的影響：取大鼠32只，隨機(jī)均分為四組。A組為正常組，其余三組動(dòng)物皮下注射單劑量TAA600mg/kg致急性肝損傷，同時(shí)給予B組生理鹽水0.4ml/kg，C組7.5%L-Arg300mg/kg，D組2.5%L

3、-NNA10mg/kg。24小時(shí)后重復(fù)注射一次。于注射TAA后48小時(shí)按實(shí)驗(yàn)(一)方法取血、肝組織，測(cè)定有關(guān)指標(biāo)。B、C、D各組均取五張HE染色肝組織切片，觀察肝組織變化。四、測(cè)定項(xiàng)目及方法：ALT、血漿內(nèi)毒素、NO3-/NO2-(鎘還原柱層析法)。肝組織勻漿自由基測(cè)定：取肝組織0.5克，制成10%組織勻漿，離心，取上清液，測(cè)定蛋白含量，LOP含量，SOD活性，GSHPX活性及肝組織光鏡下觀察肝組織病理變化。五、統(tǒng)計(jì)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。用方差齊性檢驗(yàn)，顯著性水平取a=0.05。結(jié) 果實(shí)驗(yàn)(一)急性肝損傷大鼠NO產(chǎn)生的內(nèi)毒素轉(zhuǎn)氨酶及自由基動(dòng)態(tài)觀察見(jiàn)表1。肝臟組織學(xué)檢查：TAA所致

4、的肝損傷24小時(shí)、48小時(shí)逐漸加重，72小時(shí)有肝細(xì)胞再生。實(shí)驗(yàn)(二)NO對(duì)大鼠急性肝損傷內(nèi)毒素轉(zhuǎn)氨酶及自由基動(dòng)態(tài)觀察見(jiàn)表2。肝臟組織學(xué)檢查顯示C組壞死面積小于B組，D組病變重于B組，表明使用L-Arg可減輕肝損傷，而L-NNA可加重肝損傷。討 論體內(nèi)NO生物合成是由L-Arg經(jīng)NO合成酶(NOS)催化合成NO與瓜氨酸。NOS有兩種類(lèi)型即結(jié)構(gòu)型和誘生型。肝細(xì)胞存在誘生型，在內(nèi)毒素或細(xì)胞因子刺激下可產(chǎn)生NO1。在肝病過(guò)程中，腸源性?xún)?nèi)毒素增加，肝臟功能受損，形成腸源性?xún)?nèi)毒素血癥，使NO的合成在612小時(shí)達(dá)高峰2，由于肝細(xì)胞數(shù)量大，其自發(fā)產(chǎn)生NO的量明顯高于其它細(xì)胞。NO可滅活白細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基而起

5、到保護(hù)細(xì)胞的作用3，提示NO可通過(guò)清除自由基而起到保護(hù)肝臟的作用。本實(shí)驗(yàn)表明TAA致急性肝損傷大鼠注射L-Arg、NO的合成增多，轉(zhuǎn)氨酶及肝損傷程度明顯降低；注射L-NNA組大鼠損傷程度明顯加重，表明NO對(duì)TAA誘發(fā)的肝損傷有保護(hù)作用，對(duì)肝組織自由基的測(cè)定表明抑制肝損傷大鼠NO的合成，肝組織LPO含量增高而SOD、GSHPx活性降低，SOD、GSHPx協(xié)同作用可清除體內(nèi)自由基4?？傊种芅O的生物合成、自由基水平增高，從而加重了肝損傷，與文獻(xiàn)結(jié)論一致。作者單位：030001山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科（習(xí)玲為研究生，現(xiàn)在山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院工作）參 考 文 獻(xiàn)1 Billiar TR, Cu

6、rran RD, Stuehr DJ, et al. Inducible cytosolic enxyme activity for the production of nitrogen oxides from L-arginine in hepatocytes. Biochem Biophys Res Commun, 1990, 168: 1034-1040.2 Debra LL, Marina R, Diane EH, et al. Hepatic nitric oxide production following acute endotoxemia in rats is mediated

7、 by increased inducible nitric oxide synthase gene expression. Hepatlogy, 1995, 22: 223-234.3 Rubanyi GM, Ho EH, Cantor EH, et al. Cytoprotective function of nitric oxide: inactivation of superoxide redicals produced by human leukocytes. Biochem biophys Res Commun, 1991, 181, 1392.4 Liu Ms. Activati

8、on of phospholipases A1 and A1 in heart, liver and blood during endotoxin shock. J Surgical Res, 1988, 45: 472.表1四組動(dòng)物內(nèi)毒素轉(zhuǎn)氨酶及自由基動(dòng)態(tài)變化組 別正常組24h48h72h例 數(shù)6666內(nèi)毒素與NO3-/NO2-內(nèi)毒素含量(Eu/ml)0.460±0.1301.636±0.611a3.495±0.356ab2.460±0.301abcNO3-/NO2-(mol/L)31.94±6.1760.47±7.10a88.32

9、±22.40ab71.26±15.07a轉(zhuǎn)氨酶ATL(U)30.89±18.13401.47±154.83a753.25±140.03ab402.82±197.15acAST(U)34.23±6.20362.48±146.00670.38±167.28ab318.91±145.33ac肝組織勻漿自由基LPO(mmol/mg)0.295±0.0600.582±0.120a0.931±0.117ab0.659±0.177acSOD(Eu/mg)12.19

10、77;1.249.54±1.5810.02±2.3511.60±2.09GSHPx(Eu/mg)133.12±8.5084.50±7.51a96.28±10.60ab105.17±10.35aba 與正常組比P<0.05, b 與24hr組比P<0.05, c 與48hr組比P<0.05 表2不同處理組內(nèi)毒素轉(zhuǎn)氨酶及自由基動(dòng)態(tài)觀察組 別A(正常組)B(TAA+N, S)C(TAA+L-Arg)D(TAA+L-NNA)例 數(shù)8888內(nèi)毒素與NO3-/NO2-內(nèi)毒素含量(Eu/ml)0.434±0.1

11、203.332±0.367a3.431±0.757a3.842±0.621aNO3-/NO2-(mol/L)32.75±5.1180.88±8.13a109.67±12.72ab53.37±6.66abc轉(zhuǎn)氨酶ATL(U)30.62±15.34659.35±92.83a532.08±104.67ab842.65±83.39acAST(U)34.05±5.37572.34±51.95a426.25±53.60ab581.43±88.45ac肝組織勻漿自由基LPO(mmol/mg)0.319±0.0560.586±0.070a0.409±0.116b0.797±0.112abcSOD(Eu/mg)11.78±1.310.95±1.8612.22±1.409.50