SD大鼠腦缺血模型建立

1、1. 缺血再灌注后，主要的損傷區(qū)在紋狀體， 海馬的 A1 區(qū)也會(huì)出現(xiàn)損傷。缺血再灌注損傷不是很嚴(yán)重海馬區(qū)域就沒有明顯的缺血現(xiàn)象但是紋狀體肯定有明顯的缺血現(xiàn)象。缺血 1.5 小時(shí)再灌注后我也做過尼氏染色，海馬區(qū)沒有見到缺血改變，但是紋狀體很明顯。2. #1 大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷實(shí)驗(yàn)的總結(jié)和心得本人現(xiàn)在正在做線栓法大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷實(shí)驗(yàn)（ MCAO 模型），這方面的資料我查了一些，這個(gè)實(shí)驗(yàn)我也作了一段時(shí)間，不敢說很專業(yè)了，不過現(xiàn)在基本上我能在 15min 左右完成手術(shù)，而且手術(shù)過程中不出一滴血，造模后缺血程度基本一致。雖然前面有很多前輩發(fā)了很多MCAO的很專業(yè)的貼子，不過我覺得比較凌亂,現(xiàn)在我把我的

2、心得體會(huì)和以前的貼子的精華部分奉獻(xiàn)給大家，希望這會(huì)對(duì)將要做這個(gè)實(shí)驗(yàn)的朋友有一絲的幫助。雖然做實(shí)驗(yàn)總會(huì)有郁悶的時(shí)候，不過風(fēng)雨之后總會(huì)見到彩虹的，這可以也是我的心得體會(huì)。衷心祝福大家能把實(shí)驗(yàn)做的成功、完美！實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備麻醉劑：水合氯醛（應(yīng)較好的控制大鼠體溫）保溫：60W白炙燈高度為37cm直接照射能使肛溫保持在 37C栓線的制備：1.取熔點(diǎn)為56 C的固體石蠟一塊，在瓷杯中加熱熔化。直徑為0. 24mm、長(zhǎng)5cm的魚線一端5mm長(zhǎng)的一段，垂直在熔化的石蠟中迅速浸入并提起，立即凝固的一薄層石蠟可牢固地粘附在魚線一端的表面，其直徑為 0.26mm 。就這樣，普通的魚線即可變成規(guī)相一致頭端光滑圓鈍的栓線。

3、2.在魚線 18mm 的位置用涂改液標(biāo)記一個(gè)白色點(diǎn)。TTC的配制：用0.2mol/L磷酸緩沖液（PBS）配成2%TTC溶液pH7.5） ,避光保存。體重與栓線直徑： 線栓直徑 0.24mm 采用的 SD 大鼠，體重250-300g 。實(shí)驗(yàn)方法：動(dòng)物用 10水合氯醛（ 35mg/kg ）腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），在CCA遠(yuǎn)心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA，然后近心端結(jié)扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部4mm處剪一小口，將拴線插入到ICA，這時(shí)用繞在CCA遠(yuǎn)

4、心端的細(xì)線輕輕系牢拴線。（不可過緊，否則近線困難，但松了又會(huì)出血。 ）用眼科鑷輕推拴線，從血管分叉處開始算距離， 當(dāng)插入深度在 18 mm 時(shí)（定要將血管放松至原來狀態(tài) , 且保證標(biāo)記點(diǎn)在分叉處 ,由于標(biāo)記的是白色的所以很容易看的） ，緊緊系牢 CCA 遠(yuǎn)心端的細(xì)線，此時(shí)的關(guān)鍵是動(dòng)作輕柔，不要使 ICA 有任何的牽拉，否則栓線會(huì)脫出ACA,可能會(huì)造成缺血失敗。血管外的栓線不要留得過長(zhǎng)，更不要縫在皮外，大鼠醒來后會(huì)自己拔出?？p合傷口，單籠飼養(yǎng)觀察。如果需要再灌的話,就把拴線抽出即可,因?yàn)槟X底有個(gè)動(dòng)脈環(huán),結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈大腦不會(huì)缺血的。注意事項(xiàng)：1分離時(shí)要層次清楚：正中剪開 SD 大鼠頸部皮膚,分

5、離皮下結(jié)締組織時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)該組織與頸部?jī)蓚?cè)鼓泡腺體（很多人誤認(rèn)為那是甲狀腺）結(jié)合緊密,因此不必分離過于太細(xì),直接在正中兩側(cè)鼓泡腺體之間分離,這樣能不接觸胸鎖乳突肌而直接暴露頸前頸群且不會(huì)損傷腺體造成過多出血。下一步是分開頸前肌群,這時(shí)候要注意用小鉗子作撐開分離動(dòng)作要在左右肌肉塊之間而不是一塊肌肉的肌纖維之間,雖然它們看起來很模糊,但這樣能保證不會(huì)出現(xiàn)較多條索狀細(xì)肌纖維條影響下一步頸內(nèi)動(dòng)脈的尋找與分離,并且能整塊地向一側(cè)牽開頸前肌群暴露頸動(dòng)脈鞘。見到頸動(dòng)脈鞘了則要注意細(xì)致分離迷走神經(jīng),若損傷則可能影響其呼吸而死亡的。2.分離血管時(shí),要盡量將血管剝離的干凈些,這樣在用眼科剪剪口時(shí)就不會(huì)誤剪外膜（誤剪的

6、話再剪就很容易把口剪大了或者剪斷了，要注意口子越小越好插線） ，且要剪一個(gè)斜行的切口（眼科 剪與血管約成 45 度），這樣在血液剛流出時(shí)仍能看上翻的斷口管 壁，這樣即容易插入栓線且血管受得了插線時(shí)一定的牽拉。 當(dāng)然， 切勿牽拉過猛，以免使血管發(fā)生痙攣，導(dǎo)致栓線不能順利進(jìn)入。3. 注意盡量不要損傷在頸內(nèi)頸外分叉下的交感神經(jīng)節(jié)。4. 如果你用的是中長(zhǎng)效麻醉劑，插線成功后，固定絲線，然后讓 其俯臥位，而且稍稍抬高其頸部，才能確保模型成功。5. 栓線進(jìn)入后頸內(nèi)動(dòng)脈后即可逐漸插入了， 有時(shí)候很順利一插到 底，但有時(shí)候在中間就怎么也進(jìn)不去了，這是因?yàn)樵谘苋腼B穿 過顱骨時(shí)有一個(gè)狹窄或者角度。因此，碰上這種

7、明顯阻力時(shí)，一 定不能盲目向前使力插，越插栓線前端變形越進(jìn)不去且容易損傷 血管。這時(shí)候正確的作法是往外抽出較多栓線，也許會(huì)有一定的 動(dòng)脈血流出，不必慌，只要順著血管走行調(diào)整一下進(jìn)線角度輕柔 的使勁，一般都能進(jìn)去，反復(fù)試幾次還不行最好換根栓線，很可 能前端也經(jīng)變形角度變了！ 頸內(nèi)動(dòng)脈的走向?yàn)閮?nèi)上方 ,可以用眼科 鑷夾住魚線插 ,但進(jìn)去后要注意 ,別太用力 ,要不血管就要破了6. 栓線不能在血管里反復(fù)進(jìn)退，否則及容易造成蛛網(wǎng)膜下腔出 血，而且很容易誤解為模型成功， 因?yàn)檫@時(shí)的神經(jīng)功能改變也很明顯，但并不是由于栓塞引起的7. 進(jìn)線時(shí)，使栓線有一定程度的彎曲，且只要保證栓線向屋頂方向彎曲，一般都能將線

8、插如顱內(nèi)，決不會(huì)進(jìn)入翼腭A。8. 術(shù)后一定要注意保暖。9. 插入線拴要輕柔熟練，速度盡可能快，以避免時(shí)間長(zhǎng)了血管內(nèi) 血栓形成。10手術(shù)后評(píng)分的主觀因素很大，有用 4 分制和 11 分制的，我 個(gè)人認(rèn)為用 4 分制比較準(zhǔn)些。其標(biāo)準(zhǔn)是： 0分，無神經(jīng)損傷癥狀 ; 1 分，手術(shù)對(duì)側(cè)前指不能完全 伸展；2 分，向手術(shù)對(duì)側(cè)行走； 3 分，大鼠成追尾狀運(yùn)動(dòng)。11. 性激素對(duì)腦梗死面積有較大影響，應(yīng)采用單一性別的動(dòng)物進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)。舍去標(biāo)準(zhǔn)： 栓線插入深度不足 18 mm, 且無明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)或癥狀 很輕的大鼠 蛛網(wǎng)膜下腔出血、 MCA 起始部或其附近的 willis 環(huán)動(dòng)脈有凝血塊的大鼠，因?yàn)檫@是出血性

9、腦損傷或永久性腦缺血損傷，而非MCAO/Reperfusion 損傷。3）手術(shù)時(shí)出血較多，癥狀很重的動(dòng)物。死亡原因分析： 首先要找出死亡原因，解剖死亡大鼠的腦，先看是否有蛛網(wǎng)膜下 腔出血，如有出血，表明死因是插線太深，以后注意插線深度； 如無出血，則還要再看是否有嚴(yán)重的半球水腫，如水腫嚴(yán)重，則 表明死因是腦缺血時(shí)間太重，需要縮短缺血時(shí)間；如既無出血， 又無明顯的腦水腫，那就要注意動(dòng)物狀態(tài)或生活環(huán)境是否太差。附帶的其他說明： 1.線拴法存在一定的死亡率。對(duì)于這情況我感覺比較頭疼，也希望高手指點(diǎn)。2. 模型成功率和評(píng)價(jià)指標(biāo)是相關(guān)聯(lián)的矛盾，手術(shù)后可根據(jù)動(dòng)物的表現(xiàn)加以評(píng)分，確定模型是否成功，模型成功與

10、否會(huì)對(duì)結(jié)果的評(píng) 價(jià)帶來影響。有可能你模型沒成功，結(jié)果判斷為是藥物的作用效 果。所以對(duì)手術(shù)后模型是否成功應(yīng)該進(jìn)行篩選的。另一方面，如 果你做了預(yù)防給藥，藥效的作用也容易被認(rèn)為是模型不成功，這 也需要后邊進(jìn)行腦組織染色和組織血檢查進(jìn)行驗(yàn)證。腦組織檢查 時(shí)可剔除模型不成功以及 SAH 的個(gè)例。故實(shí)驗(yàn)在手術(shù)后要進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)應(yīng)對(duì)腦組織進(jìn)行 組織學(xué)檢查或染色。 TTC 染色是采用的宏觀標(biāo)本染色，確定梗死 面積可采用體積法或面積法，但最好用掃描儀將腦組織切片進(jìn)行 掃描，選擇合適的軟件統(tǒng)計(jì)梗死面積。3.大鼠大腦中動(dòng)脈永久性閉塞性腦缺血模型，梗死體積出現(xiàn)的最 小時(shí)間點(diǎn)可能為2h,體積隨時(shí)間進(jìn)行性增大，至12h基本趨于穩(wěn)4. 整個(gè)試驗(yàn)是很費(fèi)動(dòng)物的，存在 15-30 的淘汰率（如果你做的 好），但注意嚴(yán)格控制自己淘汰的動(dòng)物（紀(jì)錄具體情況）