不同粒徑神經毒素_納米粒大鼠鼻腔給藥腦藥動學研究_百度

1、不同粒徑神經毒素 2 納米粒大鼠鼻腔給藥腦藥動學研究包 強 , 蔡鑫君 , 李范珠(浙江中醫(yī)藥大學藥學院 , 浙江 杭州 310053收稿日期 :2010-02-04, 修回日期 :2010-03-22基金項目 :國家自然科學基金資助項目 (No 30772793, 30371781 ; 浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程資助項目作者簡介 :包 強 (1984- , 男 , 碩士生 , Tel:0571286613726, E 2mail:tunshu2008;李范珠 (1964- , 男 , 教授 , 博士生導師 , 研究方向 :藥物 新劑型與新技術 , 通訊作者 , Tel:05712866

2、33030; E 2mail:lifanzhuzjtc m. net中國圖書分類號 :R 2332; R 322. 81; R 452; R 969. 1; R 977. 6;R 996. 3文獻標識碼 :A 文章編號 :1001-1978(2010 06-0731-05摘要 :目的 制備不同粒徑甲基 化 聚 乙 二 醇 (methylated 2polyethyleneglycol,Me 2PEG 修飾的神經毒素 2 (neur ot oxin, NT 2 聚乳酸 (polylactic acid, P LA 納米粒 (NT 2 2MePEG 2P LA 2NP, NT 2 2NP , 并考

3、察不同粒徑 NT 2 2NP 大鼠鼻腔給藥后腦藥動學特征 。 方法 以聚乙二醇單甲醚聚乳酸共聚 物 (M ePEG 2P LA 為納米材料 , 采用復乳 -NT 2 2NP 。 以尾靜脈注射 NT 徑 NT 2 2NP , NT 2 在 大 鼠 中 腦 導 水 管 圍 灰 質 (periaqueductal gray, P AG 部位濃度的經時變化 。 結果 不同粒徑的 NT 2 2NP呈圓形或類圓形 , 大小均勻 。大鼠鼻腔給藥后小于 100n m 的 NT 2 2NP 的 AUC (02t 分別是 100200、 200300和大于300n m NT 2 2NP 的 1122、 1134、

4、 1160倍 (P <0105 , 表明粒徑小于 100n m 時 NT 2 在腦靶部位的濃度明顯高于其他粒 徑的納米粒 。 結論 納米粒的粒徑對 NT 2 的腦內遞送有 著較為明顯的影響 , 粒徑小于 100n m 的 NT 2 2NP 可以明顯 增加 NT 2 的腦內濃度 , 這一結果為研究適宜粒徑的 NP 用 于蛋白多肽類大分子藥物入腦奠定了基礎 。關鍵詞 :神經毒素 ; 甲基化聚乙二醇 ; 粒徑 ; 納米粒 ; 大鼠 ; 鼻 腔給藥 ; 微透析 ; 腦藥動學 神經毒素 2 (neur ot oxin, NT 2 是從云南眼鏡 蛇毒液中分離得到的一種短鏈神經毒素的主要成分 , 分子

5、量約為 6700u, 是一種水溶性堿性多肽 , 其 理化性質相對穩(wěn)定 1。 NT 2 具有良好的鎮(zhèn)痛作 用 , 藥理研究已表明2, 3其作用部位為中樞神經系統(tǒng) , 臨床上主要以肌內注射方式用于控制各種疼痛 及戒毒治療 , 屬于非麻醉性神經抑制劑4。但是NT 2 分子量相對較大和大多數水溶性大分子多肽類藥物相似 , 不易透過血腦屏障 (bl ood brain barrier,BBB 進入大腦 , 需要經過一個較長時間的給藥過程 才能在中樞靶部位蓄積到有效的治療濃度 , 故起效緩慢 , 5。鼻腔給藥 (in 2tranasal adm I BBB 能力低的中樞性大分子極性 藥物 。 采用生物降解

6、型高分子材料將蛋白多肽類藥 物制成納米粒 (nanoparticle, NP , 可有效保護肽類 藥物的活性 , 并能實現(xiàn)緩釋 、 控釋和靶向釋藥目 的 7。 本研究 以聚 乙二醇 單甲 醚聚 乳 酸 共 聚 物 (MePEG 2P LA 為載體材料 , 采用復乳 -溶劑蒸發(fā)法 制備不同粒徑的 NT 2 2NP 。采用微透析取樣技術 結合熒光分光光度法測定腦靶部位藥物的濃度 , 探 討不同粒徑 NT 2 2NP 大鼠鼻腔給藥后腦藥動學特 征 。 1 材料與方法 1. 1 材料 1. 1. 1 藥品與試劑 神經毒素 2 (中國科學院昆 明動物研究所 , 質量分數 >99%, 批號 0605

7、30 ; 異 硫氰酸熒光素神經毒素 (F I T C 2NT 2 , 杭州中泰生物 技術有限公司標記 , 批號 CH 205200301 ; 聚乙二醇 單甲醚聚乳酸共聚物 (山東岱罡生物科技有限公 司 , 批號 070601 ; 泊洛沙姆 188(德國 BASF 公司 , 批號 W PT B649C ; 右旋糖苷 270(美國 Sig ma 公司 , 批號 1720280201 ; 人工腦脊液 (自制 :145mmol L-1NaCl, 317mmol L-1KCl, 110mmol L-1MgCl 2, 112mmol L -1CaCl 2, 10mmol L -1NaH 2CO 3, 01

8、1mmol L -1抗壞血酸 , pH 714 ; 其余試劑均為國產分析純 。1. 1. 2 儀器與設備 超速離心機 (美國 Beck man 公司 ; 超聲波細胞粉碎機 (中國寧波新芝生物科技 股份有限公司 ; 小型冷凍干燥機 (美國 Labconco 公 司 ; 激光粒度測定儀 /Zeta 電位儀 (美國 N icomp 公司 ;Modulus T M單管型多功能光度計 (美國 Turner B i 2osyste m s 公司 ; 熒光分光光度計 (日本島津公司 ; 大鼠鼻黏膜給藥裝置 (專利號 :20052001352515 ; 微透析腦立體定位架及實驗裝置系統(tǒng) (美國 BAS 公13

9、7 中國藥理學通報 Chinese Phar m acological B ulletin 2010Jun; 26(6 :7315司 。1. 1. 3 實驗動物 清潔級 S D 大鼠 , 兼用 , 體 重約 300g, 由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供 (合格證號 :SCXK 滬 200720005 。 所有動物實驗均 按照浙江大學動物飼養(yǎng)和使用指南進行 。1. 2 方法1. 2. 1 4組不同粒徑的 NT 2 2NP 制備 稱取 40 mg MePEG 2P LA 溶于 110m l 乙酸乙酯中 , 精密加入 40l 的 F I TC 2NT 2 (1g L -1 水溶液 , 渦旋乳化 40

10、s, 再加入 2m l 泊洛沙姆 188水溶液 (或右旋糖 苷 270 , 冰浴下探頭超聲乳化 30s, 將制得的復乳轉 移至 013%P VA 水溶液 100m l 中 , 旋轉蒸發(fā) 30m in 除去有機溶劑 , 超速離心 (30000r m in -1 30m in, 并用蒸餾水洗滌 3次 , 沉淀凍干后即得 2。 1. 2. 2 形態(tài) 取 4液適量 , , 室溫 。 1. 2. 3 粒徑和 電位 取 4組不同粒徑的 NT 2 2 NP 膠體溶液適量 , 用激光粒度儀測定其粒徑 、 多分 散系數 (P 1I 及 電位 。1. 2. 4 包封率和載藥量 NT 2 的投料量計為 C 0, 取

11、離心后的上清液測定濃度計為 C1, 計算包封率 (C 0-C 1 /C0×100%;NT 2 2NP 的濃度計為 M (NT 2 2NP 凍干后的質量與膠體溶液的體積比即為 M , 計算載藥量 (C 0-C 1 /M ×100%。1. 2. 5 溶液配制 F I TC 2NT 2 溶液 :稱取一定量的 F I TC 2NT 2 溶液 , 置于 2m l 的容量瓶中 , 加人工腦 脊液溶解并定容至刻度 , 得到濃度為 1g L -1的 F I TC 2NT 2 人工腦脊液溶液對照品 。 F I TC 2NT 2 2NP 溶液 :取按“ 11211” 項下得到的 NT 2 2N

12、P 適量 , 置于 100m l 的容量瓶中 , 均勻分散 在人工腦脊液膠體溶液中既得 。1. 2. 6 標準曲線 精密量取 F I TC 2NT 2 溶液適 量 , 置 1m l 容量瓶中用人工腦脊液定容 , 準確稀釋 至濃度為 015、 5、 25、 50、 75、 100g L -1標準系列溶液 。 以人工腦脊液為空白 , 在激發(fā)波長 ex=488 n m , 發(fā)射波長 em =520nm 下進行熒光測定 , 以熒 光強度 F 對藥物濃度 (g L -1 進行線性回歸 , 得到回歸方程 。1. 2. 7 大鼠腦微透析手術操作 S D 大鼠水合氯醛 (300mg kg -1 i p 麻醉

13、, 俯臥位固定于腦立體定位 儀上 。 顱頂皮膚消毒后矢狀切開大鼠頭部正中皮 膚 , 暴露顱骨 。 用牙科高速鉆機在顱骨上鉆開一直 徑約 015mm 的小孔 。 將微透析探針插入腦骨表面 下 614mm (即左側 P AG 部位 , 用牙托粉和螺釘將 微透析底座固定在顱骨上 , 縫合皮膚 。1. 2. 8 微透析探針在體回收率測定 8 運用反透 析法測定 NT 2 微透析腦探針的在體回收率 。按 “ 11217” 項下操作 , 微透析腦探針埋植手術結束后 , 使用濃度分別為 10、 50和 100g L -1的 F I T C 2NT 溶液灌流 , 流速為 2l m in -1, 每 30m i

14、n 收集 1次 透析液 , 收集 3h 。 采用單管型多功能光度計測定透析液中對照品 濃度 , 根據公式 回收率 /%=C -CC per×100%計 (C C 、 灌流液 中 F I 取 S D 大鼠 5組 , 每組 5只 :NP 2 尾靜脈注射 NP(iv 、 NP 2 鼻腔給藥組 NP 2 (in 、 NP 2 鼻腔給藥組 NP2 (in 、 NP 2 鼻腔給藥組 NP2 (in 、 NP 2鼻 腔 給 藥 組 NP 2 (in 。按 “ 11217” 項下進行手術 , 探針透析膜埋植手術結束 后灌流人工腦脊液 , 流速 2l m in -1, 平衡 30m in 。 采用大鼠

15、鼻腔給藥裝置給藥 , 劑量相當于 60g kg -1的 NT 2 , 同時使用自動恒溫冷凍收集器收集 透析液 , 間隔 30m in, 收集 480m in 。透析液測定其 熒光強度 , 并折算成 NT 濃度 。 通過 NT 2 在體回收 率校正 , 得到各時間點的腦內 NT 2 實際濃度 。 1. 2. 10 數據處理與藥動學參數的計算 使用非隔 室模型方法處理數據 , 計算相關藥代動力學參數 , C max 、 T max 為實測值 , AUC (02t 采用梯形法計算 。用 O ringin610軟件進行方差分析及配對 t 檢驗 , 藥物動 力學參數見 Tab 2。2 結果2. 1 NT

16、 2 2NP 形態(tài) 不同粒徑的 NT 2 2NP 外觀 為乳白色膠體溶液 , 電鏡下呈圓球形 , 大小均勻 。 2. 2 NT 2 2NP 的粒徑 、 電位 、 包封率和載藥量 用復乳 -溶劑揮發(fā)法制備的不同粒 NT 2 2NP 的粒 徑 、 電位 、 包封率和載藥量見 Tab 1。2. 3 透析樣品測定的標準曲線 結果表明 , F I T C 2 NT 2 在 015100g L -1范圍內與熒光強度呈良 好的線性關系 , 回歸方程 F =751704+51802(n = 6, r =019995 。2. 4 F I TC 2NT 2 微透析探針在體回收率 I T C 2 NT 2 微透析探

17、針在 P AG 部位的在體平均回收率為 (1511±111 %。 該回收率用于透析部位藥物實際 濃度的校正 。2. 5 NT 2 2NP 的藥時曲線與藥動學參數 大鼠 腦微透析實驗過程示意圖見 Fig 1。 4組不同粒徑237 中國藥理學通報 Chinese Phar m acological B ulletin 2010Jun; 26(6Tab 1 Parti cle si ze, P . I , electr i c poten ti a l, en trap m en t eff i c i ency and load i n g capac ity of NT 2 2NP (

18、 x ±s, n =5 Particle size /nmP . I Electric potential/mVEntrapment efficiency/%Loading capacity/%NP 2 70. 4±8. 60. 126±0. 05-9. 94±1. 5381. 14±2. 950. 34±0. 10NP 2 127. 8±12. 30. 166±0. 06-14. 91±1. 3181. 50±2. 350. 42±0. 11NP 2 266. 8±10.

19、50. 080±0. 03-12. 87±1. 0883. 38±3. 220. 29±0. 12NP 2322. 5±8. 90. 034±0. 02-21. 36±1. 3683. 73±3. 430. 35±0. 08Tab 2 The phar macok i n eti ca l param eters i n PAG after i n trana s a l ad m i n istra ti on of four NT 2 2NP ( x ±s, n =5Para meterNP

20、 2 NP 2 NP 2 NP 2 NP (iv C max /g L -124. 89±1. 56321. 64±0. 7718. 25±0. 8116. 37±1. 8814. 95±1. 90T max /h1. 78±0. 081. 80±0. 121. 97±0. 052. 01±0. 092. 41±0. 16MRT/h3. 32±0. 143. 59±0. 093. 62±0. 163. 71±0. 153. 98±0. 16AUC

21、 /g h L-1103. 69±9. 7894. 45±9. 0989. 59±72. 26±15. 77 3P <0105vs NP 2 , NP 2 , NP 2 ; P <0105vs NP 2 , NP 2 , NP 2 .NT 2 2NP 大鼠鼻腔給藥后的藥時曲線見 2動學參數見 Tab 2(iv 相比 , 4組 不 同 粒 徑 2腔 給 的 AUC (0-t 、 C max P <0105 。 NP 2 的 AUC (0- 、 C max 均高于 NP 2 、 NP 2 和 NP 2 , 而 T max 均小于其他 3組

22、(P <0105 。F i g 1 Sche ma ti c d i a gram of ra t bra i n m i crod i a lysisF i g 2 The prof iles of m ean drug PAG concen tra ti on 2ti m e afteri n trana s a l ad m i n istra ti on of four NT 2 2NP (n =53 討論 根據文獻和前期研究 8, 9發(fā)現(xiàn) , 復乳 -溶劑揮發(fā)法制備 NT 2 2NP 時 , 乳化劑的種類與濃度 、 超聲 時間 、 稀釋劑的濃度等因素對 NT 2 2NP 粒徑大

23、小 都有影響 , 本實驗通過改變乳化劑的種類 (泊洛沙 糖 苷 270 和 濃 度 (泊 洛 沙 姆 188214%和 115%, 右旋糖苷 270, 016%和 115% 、 超 聲時間 (30s 、 18s 、 15s 、 9s , 制備 4組不同粒徑的 NT 2 2NP, 記做 :NP 2 、 NP 2 、 NP 2 、 NP 2 。 在中樞神經系統(tǒng)中從 P AG 到脊髓的下行抑制 通路是比較肯定的與陣痛有關 , 即中腦 P AG 與中樞陣痛部位有著密切的聯(lián)系 10。 P AG 對痛覺有高度 選擇性抑制性作用 , 可調節(jié) G ABA 、 谷氨酸等神經遞 質的釋放11, 12。所以 , 本

24、實驗中透析液采集選擇P AG 部位 。 鼻腔給藥是一種實現(xiàn)多肽類藥物腦內遞藥的有 效方法之一 , 納米粒作為多肽類藥物的載體 , 粒徑是影響其入腦的重要因素之一 13。從 Tab 2可知 ,在給藥 劑 量 相 同 的 前 提 下 , 4組 鼻 腔 給 藥 組 的 AUC (0-t 和 C max 分別為 (127101±12132 g h L -1和 (24189±1156 g L -1, (103169±9178 g h L -1和 (21164±0177 g L -1, (94145±9109 g h L -1和 (18125±0

25、181 g L -1, (89159±10174 g h L -1和 (16137±1188 g L-1, 各 組 不 同 粒 徑 NT 2 2NP 經 鼻 腔 給 藥 后 的AUC (0-t 為靜脈注射組 NP (iv 的 117、 115、 112、 111倍 (P <0101 , C max 為 NP (iv 組的 116、 115、 113、 111倍 , 說明 NT 2 2NP 經鼻腔給藥后藥物腦內遞送的 程度和速度均優(yōu)于靜脈注射 。 可能的原因是由于鼻 腔和顱腔在解剖和生理上的獨特聯(lián)系 , 藥物可能繞過 BBB 經嗅區(qū)鼻 -腦通路直接進入腦內 14, 因此

26、 腦內藥物濃度可能高于其它給藥途徑 。 鼻腔黏膜上皮只有一層纖毛柱狀上皮細胞構成 , 而且上皮細胞下存在著豐富的毛細血管和毛細 淋巴管 。 鼻腔給藥后 , 少部分藥物經過嗅神經通路 和嗅黏膜上皮通路直接進入大腦 , 但大多數藥物被 呼吸道黏膜吸收進入血液循環(huán) , 進而透過血腦屏障337 中國藥理學通報 Chinese Phar m acological B ulletin 2010Jun; 26(6進入腦 組 織 15。有 研 究 認 為 16NP 可 能 是 通 過BBB 表面內皮細胞的胞轉作用進入大腦 , 而且較小 粒徑的 NP 越容易透過 BBB 上的血管內皮細胞 。 本 實驗 中 ,

27、與 NP 2 、 NP 2 、 NP 2相 比 , NP 2的 AUC (0- 分別為其它 3組的 1122、 1134、 1160倍 (P <0105 , C max 分別為其它 3組的 112、 113、 115倍 (P <0105 。 說明粒徑對 NP 的入腦有著較為明顯的 影響 , 粒徑小于 100nm 時 NT 2 2NP 可以明顯增加NT 2 的腦內濃度 。 Lock man 等 17提出 , 構建理想的入腦 NP 的粒徑應小于 100n m 。 Kuo 等 18通過 體外研究發(fā)現(xiàn) , 隨 NP 粒徑增大 , 其體外 BBB 透過率 降低 。 從藥時曲線圖及藥動學參數可

28、以看出 , 與 NP 2 、 NP 2 、 NP 2 相比 , NP 2 鼻腔給藥后腦內濃 度明顯增加 , 入腦遞送時間相對加快 , 含量增加是否能提高 NT , 與藥效學的結合研究 面的研究 。 采用微透析取樣技術 19對具有腦靶向性的藥 物進行藥動學研究 , 透析液中的藥物濃度真實的代 表了腦靶部位細胞外液中非結合藥物濃度的經時變 化 , 而且取樣技術不影響實驗動物的正常生理功能 。 本實驗以清醒自由活動的大鼠為實驗模型 , 運用腦 微透析技術研究了不同粒徑 NT 2 2NP 鼻腔給藥的 腦內藥物動力學過程 。 參考文獻 :1 Chen R Z, Robins on S E . The e

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40、eti ca l study of d i fferen t d i a m etersneurotox i n 2 nanoparti cles after i n trana s a l ad m i n istra ti on i n ra tsBAO Q iang, CA I Xin 2jun, L I Fan 2zhu(College of Phar m aceutical Science, Zhejiang U niversity of Traditional Chinese M edicine, Hangzhou 310053, China Abstract:A i m To p

41、 repare NT 2 l oaded nanoparti 2cles with different dia meters modified by Methylated 2437 中國藥理學通報 Chinese Phar m acological B ulletin 2010Jun; 26(6polyethyleneglycol (Me 2PEG and evaluate their brain phar macokinetics after ad m inistered nasally in rats . M ethods NT 2 2NP was p repared by e mulsi

42、 on /s ol 2 vent evaporati on method and MePEG 2P LA was used as the carrier material . M icr odialysis technique and fluo 2 r os pectr ophot ometry were used t o deter m ine NT 2 concentrati on after nasal adm inistrati on in the brain of rats . Results The appearance of allNT 2 2NP gr oup s was r

43、ound or si m ilar . The AUC (0-t of bel ow 100n m NT 2 2NP was 1122f old as that of 100200nm NT 2 2NP, 1134f old as that of 200300nm and 1160 fold as that of exceed 300n m NT 2 2NP (P <0105 treated nasal ad m inistrati on in rats . The quantity and s peed of bel o w 100nm NT 2 2NP was re markably

44、 higher than the other three size NT 2 2NP . Conclu 2 si on s The size of NP has s ome significant influence on drug delivery t o the brain . W hen the dia meter is be 2 l ow 100nm , the NT 2 2NP significantly i m p r oves the NT 2 concentrati on level in brain . The outcomes of this research p r ov

45、ide a feasible path t o devel op suitable dia meter NP f or the adm inistrati on of giant molecule drug such as p r otein and polypep tide .Key words:neur ot oxin 2 ; Methylated 2polyethyleneg 2 lycol; particle dia meter; nanoparticle; rats; intranasal ad m inistrati on; m icr odialysis; brain phar macokinetics丹皮酚對人肝癌 BE L 27402細胞凋亡和 CO X 22、 Surv i v i n 、 X I AP 、 c 2I AP1表達的影響 彭萬仁 , 付衛(wèi)爭 , 孫國平 , 范璐璐 , 葛 磊 , 吳志麗(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內科 , 安徽 合肥 230022中國 圖 書 分 類 號 :R 284. 1; R 329. 24; R 329. 25; R 735. 702. 2; R 9