3130簡明使用手冊

1、 AppliedBiosystems 3130簡明使用手冊AppliedBiosystems 3130/3130XL 簡明使用手冊DATA COLLECTION V3.0美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司中國公司否否否是是是是儀器準備P7需要空間定位？運行測序樣品？進行空間定位P11進行光譜校正P12需要光譜校正？運行片斷分析樣品？上機運行P29編制測序樣品板文件P20編制片斷分析樣品板文件P27結(jié)果分析，參考相關(guān)手冊一DNA 測序或片段分析的流程：1.樣品制備： 樣品制備即是在DNA片斷上用化學(xué)的方法標記熒光素。 標記上熒光素后就可以對DNA片斷進行檢測和確認了，一般每一 DNA分子標記一個熒光素分子，最

2、多有五種熒光素可用于DNA樣品的標記。 不同的樣品制備方法選用不同的熒光素和試劑的組合，樣品制備可在96孔或384孔板進行2.軟件設(shè)置：操作人員根據(jù)所使用的標記方法、電泳的毛細管長度、電泳膠的種類等，在數(shù)據(jù)采集(Data Collection)軟件中選擇正確的運行模塊和分析模塊。 3.開始運行：操作人員把樣品板放到儀器上并開始運行，儀器便會根據(jù)設(shè)定好的順序，用相應(yīng)的電泳程序分析樣品板上的樣品。 4.電泳：用“電進樣”的方法將帶電的樣品分子加到灌好電泳膠的毛細管的進樣端（負極）， 然后在毛細管兩端加上直流電壓，樣品中不同大小的DNA片段開始從負極向正極移動， 移動的速度受到片段自身大小影響，片斷

3、越短移動得越快。電泳的結(jié)果是使長度不同的 帶電 DNA 片斷互相分離，并且按片段的長短的順序通過檢測窗口，產(chǎn)生信號，短片段先到達檢測窗口。5.激發(fā)和檢測：當(dāng)標記有熒光素的DNA片斷移動到檢測窗口時，熒光素受到激光束的激發(fā)而產(chǎn)生熒光信號，此熒光信號被CCD檢測器所檢測并被轉(zhuǎn)化為電信號傳遞到計算機。6.數(shù)據(jù)采集和處理：CCD檢測器把檢測到的熒光信號轉(zhuǎn)換為電信號，并把它傳送給安裝了Data Collection軟件的計算機工站。工作站接收到信號后，用預(yù)先設(shè)置好的方式進行初步處理，并把這些數(shù)據(jù)存貯在計算機的數(shù)據(jù)庫里。 7.自動數(shù)據(jù)提取和分析：接著，工作站會自動地從數(shù)據(jù)庫中提取這些數(shù)據(jù)，并根據(jù)不同的運行

4、模式，完成對樣品DNA的堿基序列或片斷信息的分析，然后把分析完成后的結(jié)果數(shù)據(jù)以樣品文件的形式保存于計算機的硬盤中。8.結(jié)果：分析好的樣品文件可以用序列分析軟件或片斷分析軟件來打開查看結(jié)果，如有必要，這些數(shù)據(jù)可以改用不同的分析參數(shù)進行重新分析。 電泳信號圖的X軸表示時間，Y軸表示相對熒光強度，圖上不同顏色的信號線代表了樣品制備時所使用的不同的熒光素（對于測序結(jié)果，每種顏色代表一種堿基），圖中的每個峰代表一個DNA片斷。 測序樣品的結(jié)果圖片斷分析的結(jié)果圖二儀器硬件結(jié)構(gòu)：1.儀器前視圖： 泵膠塊膠管膠瓶陽極緩沖液杯膠泵（PDP）連接管 . 下膠塊 2.各部件功能：l 電源開關(guān)：打開或關(guān)閉儀器電源；

5、l 照明燈開關(guān)：打開或關(guān)閉儀器內(nèi)部的照明燈； l 陽極緩沖液杯：內(nèi)裝1X緩沖液，電泳時作為陽極介質(zhì)； l Buffer杯：裝1X緩沖液，電泳時作為陰極介質(zhì)； l 水杯：裝去離子水，清洗毛細管用或放廢膠；l 泵膠塊：泵入膠并將其灌入毛細管； l 下膠塊：上裝有陽極，陽極緩沖液杯裝在此處；l 恒溫加熱爐：保證電泳時，毛細管處于一個均一、穩(wěn)定的溫度環(huán)境中；3.儀器后視圖：注意：請保持激光冷卻風(fēng)扇的出口通暢！三實驗操作：1.儀器準備：開機：開機的順序一定是先開電腦再開儀器。l 開啟UPS電源，確保UPS處于電池供電狀態(tài)，穩(wěn)定5分鐘；l 打開顯示器和電腦的電源開關(guān)，登錄到WIN XP桌面；l 檢查確保儀

6、器的加熱爐門和儀器左右前門；l 打開儀器電源開關(guān)，儀器進行一系列的初始化后，綠色狀態(tài)燈亮，儀器啟動完成。儀器的狀態(tài)指示燈的不同狀態(tài)顯示了儀器處于不同的工作狀態(tài)，具體請參考下表：狀態(tài)指示燈操作l 儀器已就緒l 關(guān)門狀態(tài)下進行向?qū)Р僮骶G燈長亮l 繼續(xù)實驗l 程序運行中綠燈閃爍l 儀器與電腦無法聯(lián)機黃燈長亮l 確認已進入WIN XP界面l 確認網(wǎng)線連接正確l 確認前門關(guān)閉l 儀器下載firmwarel 儀器自檢l 加熱爐門打開l 前門打開l 開門狀態(tài)下進行向?qū)Р僮鼽S燈閃爍l 確認前門，加熱爐門已關(guān)閉l 故障紅燈長亮l 關(guān)機后等待30秒后開機l 若上一步無效則打開DC3.0軟件，進入以下界面 GA I

7、nstruments > ga3130 >instrument name > Instrument Status >Event Log. 查看日志中最后一條信息，根據(jù)相應(yīng)錯誤代碼來解決問題l 若依然無法解決問題，聯(lián)系A(chǔ)BI工程師打開Data Collection3.0軟件：l 選擇Start> Programs >Applied Biosystems >Data Collection >Run Data Collection v3.0. 或雙擊桌面快捷方式。l 等待Service Console窗口中的指示燈全部變成綠色后，DC軟件的界面打開，過

8、程如下：沖洗Water Seal：1、 在20ml的注射器里裝上20ml去離子水（水溫40ºC以下），將注射器裝到右圖中2號的位置；2、 將1號和2號位上的螺母都放松1/2圈；3、 用燒杯在1號口底下接收流出來的水，然后慢慢地壓注射器，使水通過Water Seal后從1號口流出，要求使用水的體積在10ml以上；4、 擰緊2號位上的螺母，再擰緊2號位上的螺母；5、 取下20ml注射器，沖洗步驟完成。安裝毛細管：l 在DC軟件中，選擇GA Instruments>ga3130>instrument name>.l 在工具欄中，選擇Wizards>Install A

9、rray Wizard.l 按照向?qū)崾静僮鱨 安裝好毛細管以后運行毛細管空間定位程序spatial calibration注意：l 不要拉扯毛細管l 使用原包裝來儲存使用過的毛細管，其末端分別放在緩沖液槽和小玻璃瓶中l(wèi) 安裝毛細管時要戴無粉手套更換新的膠：l 在DC軟件中，選擇GA Instruments > ga3130 >instrument name >.l 在工具欄中，選擇Wizards,然后選擇Replenish Polymer Wizard進行同種類型的膠的更換，選擇Change Polymer Type Wizard進行不同類型的膠的更換。l 按照向?qū)崾静僮?/p>

10、注意：l 每天都要檢查膠塊和連接管中有無氣泡；l 確保有足夠量的膠每輪消耗約50-80ul；l 每星期都要更換膠；l 使用過期的膠可能會影響數(shù)據(jù)質(zhì)量；l 請戴無粉手套操作。準備緩沖液：l 把5ml 10X緩沖液與45ml MilliQ水混合成1X緩沖液；l 按下Tray按鈕，待自動進樣器停止移動后開門；l 取下緩沖液槽，水槽和廢液槽，拆開并用水清洗；l 晾干，在各槽中加入相應(yīng)的溶液；l 擦干各槽后將其放回儀器相應(yīng)的位置上；l 取下陽極緩沖液杯，倒空后先用水淋洗再用1X緩沖液洗；l 加入緩沖液；l 將陽極緩沖液杯裝回原處。注意：l 溶液槽組裝好后，請仔細檢查，橡膠墊是否平整；l 1X緩沖液在28

11、度可放置1個月，室溫可放置1星期；l 請每24小時更換儀器上在使用的緩沖液；l 如果有膠沖入陽極緩沖液杯中請更換緩沖液。2.毛細管空間定位 ( Spatial Calibration ):什么是毛細管空間定位？毛細管空間定位程序把每道毛細管的熒光信號落在CCD上的位置標記出來，從而使DC軟件能夠找到這些信號。何時作毛細管空間定位？1 安裝新毛細管或用過的毛細管后；2 移除或調(diào)節(jié)了毛細管檢測窗口的位置；3 移動儀器后。如何作毛細管空間定位？l 選擇GA Instruments > ga3130 >instrument name > Spatial Run Scheduler.l

12、 若毛細管中充滿了新膠，選擇Protocol> SpatialNoFill_1，否則選擇Protocol> SpatialFill_1l 點擊Start按鈕l 評估定位結(jié)果，各道的信號高度應(yīng)該相差不大，間隔13至16之間，確認所有毛細管都有信號，如圖：l 若接受定位結(jié)果，按Accept按鈕，否則按Reject按鈕若空間定位失敗l 重復(fù)以上過程進行定位l 若無效，觀察系統(tǒng)中有無氣泡，去除氣泡后再進行空間定位l 若無效，重新安裝毛細管的檢測窗口，進行空間定位l 若無效，取下毛細管，用槍吸取無水甲醇沖洗毛細管檢測窗口上的凹槽，如圖l 待甲醇晾干后將毛細管裝回，進行空間定位檢測窗口的前表面

13、l 若無效，更換毛細管3.光譜校正（spectral calibration）：什么是光譜校正？從下圖可以看到，四（或五）色熒光檢測系統(tǒng)的本質(zhì)是檢測四（或五）種熒光素在其中心發(fā)射波長處的信號。由于每一種熒光素的發(fā)射光譜不是銳線光譜，而是 一種有一定寬度分布的光譜帶。所以一個純熒光除在它自己光譜的中心波長處能采 集到信號N1外，在其他熒光信號光譜的中心波長處亦能檢測到信號而產(chǎn)生信號重疊。為了校準信號重疊，需知道一種熒光信號在其他熒光信號處產(chǎn)生的重疊系數(shù)。 所以，我們用四（或五）條不同長度的片斷分別標記上不同的熒光素來計算這些系數(shù)。最后得到一個（或）的數(shù)據(jù)矩陣。 何時作光譜校正？l 使用新的熒光染

14、料l 激光或CCD被調(diào)節(jié)或更換后l 不同顏色的熒光間出現(xiàn)干擾（有拔起或下壓峰）l 參數(shù)的改變（熒光類型，毛細管類型和毛細管長度）如何作光譜校正？兩種類型的校正標準樣品樣品準備l 按照試劑盒說明書用Hi-Di甲酰胺混合校正標準樣品l 震蕩離心l 95度變性5分鐘后立即冰浴2分鐘l 震蕩離心l 在樣品板中加入樣品（96孔板加10ul，384孔板加5ul）l 用橡膠墊裝配樣品板，裝配后橡膠墊必須平整，樣品板上的孔與橡膠墊上的孔要對齊，如圖橡膠墊未對齊樣品孔橡膠墊未對齊樣品孔橡膠墊未對齊樣品孔橡膠墊對齊了樣品孔l 短甩離心，<1500g X 5sl 確認所有孔的樣品都在底部,如右圖l 按下圖組裝

15、樣品板 樣品在底部樣品板固定器橡膠墊樣品板樣品板基座組裝好的樣品板注意！固定器與橡膠墊的孔一定要對齊， 否則會損毀毛細管！固定器與橡膠墊的孔沒有對齊創(chuàng)建光譜校正用的protocoll 選擇GA Instruments > ga3130 >Protocol Manager.l 在Instruments Protocols界面中點擊New按鈕l 在Name中為Protocol命名l 在Type下拉菜單中選擇Spectrall 依次選擇正確的DyeSet、Polymer、Array Length、 Chemistry和Run Module，點擊OK。創(chuàng)建光譜校正板l 選擇GA Instr

16、uments > ga3130 >instrument name > Plate Manager.l 點擊New按鈕，在彈出窗口中分別輸入以下信息樣品板名字可選項：樣品板的相關(guān)描述選擇Spectral Calibration選擇96-well輸入所有者的名字輸入操作者的名字點擊OK按鈕l 在Spectral Calibration Plate Editor dialog界面中，輸入以下信息樣品名 相關(guān)信息 前面創(chuàng)建的Protocoll 點擊OK按鈕，則一個樣品板記錄創(chuàng)建完成運行光譜校正板：l 選擇GA Instruments > ga3130 >instrumen

17、t name > Run Scheduler.l 將樣品板放到自動進樣器上，注意板的方向，此時RunScheduler界面中板的指示塊由灰色變?yōu)辄S色l 點擊FindAll按鈕，找到光譜校正的樣品板的文件名l 點擊該文件名后，再點擊黃色的板的指示塊，此時，指示塊將右黃色變?yōu)榫G色l 在DC軟件的工具欄中，點擊，在隨后的對話框中點擊OK來開始運行確認光譜校正成功/失敗狀態(tài)l 選擇GA Instruments > ga3130 >instrument name > Instrument Status > Event Log.l 查看各道毛細管的狀態(tài),如下圖l 相關(guān)標準 毛

18、細管位置 是否成功 Q值 Condition number查看光譜校正結(jié)果l 選擇GA Instruments > ga3130 > instrument name > Spectral Viewer.l 在Dye Set下拉菜單中，選擇相應(yīng)的熒光染料l 在樣品板圖上選擇某個孔來查看其光譜校正結(jié)果Dye Set ZDye Set EDS-33(G5)故障排除癥狀可能原因解決方法無信號樣品預(yù)處理問題更換樣品，使用新的HI-DI甲酰氨樣品板中有氣泡離心光譜校正失敗或顯示“No candidate spectral files found”毛細管阻塞手工命令灌膠，觀察毛細管在陰極的

19、噴膠情況來判斷其是否阻塞毛細管未充滿膠檢查是否有毛細管斷裂，重新灌膠過期的光譜校正樣品檢查保質(zhì)期和儲存條件，必要的話更換新批號的樣品有很多雜峰膠過期更換新膠氣泡，尤其在膠中l(wèi) 使用Bubble Remove向?qū)Ч嗄zl 使用前要使膠升溫至室溫l 更換過期的膠膠污染更換新膠4.設(shè)置DNA測序程序創(chuàng)建Instrument Protocoll 選擇GA Instruments> ga3130 > Protocol Manager.l 在Instrument Protocol界面中，點擊New按鈕l 填寫彈出的Protocol Editor窗口名字描述選擇REGULAR按照下表的內(nèi)容選擇相應(yīng)

20、的Module按照下表的內(nèi)容選擇相應(yīng)的Dye SetRun ModuleDye Setl 點擊OK按鈕創(chuàng)建Analysis Protocoll 選擇GA Instruments> ga3130 > Protocol Manager.l 在Analasis Protocol界面中，點擊New按鈕l 選擇Sequencing Analysis，點擊OK按鈕l 填寫General菜單名字和描述按下表選擇相應(yīng)的序列文件格式文件格式選項含義Write .Seq File .seq文件用文本文件格式來打印序列或用在其它軟件中l(wèi) ABI格式用于Applied Biosystems軟件l FAST

21、A格式用于其它軟件Write Standard Chromatogram Format file (.scf)創(chuàng)建.scf文件用于其它軟件Write Phred (.phd.1) File當(dāng)KB basecaller同時被使用時，創(chuàng)建.phd.q文件來用于其它軟件l 填寫B(tài)asecalling菜單選擇合適的basecaller和DyeSet Primer如果愿意，可以選擇分析的中止點選擇Quality Threshold選項選擇True或Flat ProfileProcessed Data選項功能使用同一的標準來處理顯示數(shù)據(jù)，使得其最強區(qū)域的峰高為一固定值。處理后的圖譜與原始圖譜類似。不同的區(qū)

22、域不同處理，使得中間區(qū)域（>約40堿基）的峰高相平注意：只能在使用KB basecaller分析時使用，若使用ABI basecaller必須用True ProfileQuality Threshold選項功能使用KB basecaller時，每個位置都要分配一個堿基和相應(yīng)的QV值使用KB basecaller時，低于設(shè)定的QV值的位置標記Ns，依然會顯示其QV值l 填寫Mixed Baeses菜單（只有在使用KB Basecaller選項時才能激活該菜單）選擇Use Mixed Base Identification選項設(shè)置相應(yīng)的檢測域值（默認為25%，不能低于15%）l 在Clear

23、 Range菜單中，選擇相應(yīng)方法l 點擊OK按鈕保存設(shè)置 Result Group，具體如下，設(shè)置完成后，點擊 OKl 選擇GA Instruments > Results Group.l 點擊New按鈕創(chuàng)建新Result Group或Edit按鈕編輯已有的Result Groupl 填寫General界面填寫名字 填寫所有者（可選）填寫描述（可選）l 填寫Analysis界面分析類型中選擇Sequencing Analysis選擇是否需要程序結(jié)束后自動分析l 填寫Destination界面（若想使用默認文件夾位置則跳過以下內(nèi)容）點擊Use Custom Location選擇框自定義文件

24、夾位置點擊Browse按鈕來瀏覽文件夾位置點擊Test按鈕來測試選擇的文件夾位置是否成功l 在Naming界面中按自己的習(xí)慣定義命名規(guī)則創(chuàng)建序列分析樣品板記錄l 選擇GA Instruments > ga3130 >Plate Manager.l 點擊New按鈕l 在彈出的New Plate Dialog窗口中填寫以下內(nèi)容樣品板名字樣品板描述（可選）選擇相應(yīng)的測序程序選擇96孔板輸入所有者和操作者的名字點擊OK按鈕l 在彈出的Sequencing Analysis Plate Editor窗口中，填入相關(guān)內(nèi)容n 在Sample Name欄中填入樣品名n 在Comments欄中填入相

25、關(guān)描述n 在Results Group 1欄中選擇上面創(chuàng)建的Result Groupn 在Instrument Protocol 1欄中選擇上面創(chuàng)建的Instrument Protocoln 在Analysis Protocol 1欄中選擇上面創(chuàng)建的Analysis Protocoll 使用Fill Down功能來完成有相同設(shè)置的樣品填寫l 若想讓樣品運行一輪以上，選擇Edit > Add Sample Run并填寫相關(guān)信息l 點擊OK按鈕5.設(shè)置片段分析程序創(chuàng)建Instrument Protocoll 選擇GA Instruments> ga3130 > Protocol

26、Manager.l 在Instrument Protocol界面中，點擊New按鈕 l 填寫彈出的Protocol Editor窗口名字描述選擇REGULAR選擇GeneMapper36_POP7選擇G5點擊OK按鈕Run Modules:DyeSet:設(shè)置Results Group，參考第24頁，只需將分析類型改為GeneMapper。創(chuàng)建片段分析樣品板記錄l 選擇GA Instruments > ga3730 >Plate Manager.點擊New按鈕l 在彈出的New Plate Dialog窗口中填寫以下內(nèi)容樣品板名字樣品板描述（可選）選擇相應(yīng)的GeneMapper程序選

27、擇96孔板輸入所有者和操作者的名字點擊OK按鈕l 在彈出的GeneMapper Plate Editor界面中，填寫以下信息1. 在Sample Name欄中，輸入樣品名2. 在Comment欄中，輸入相關(guān)描述3. 在Sample Type欄中，選擇樣品類型4. 在Size Standard欄中，選擇合適的內(nèi)標5. 在Panel欄中，選擇合適的panel6. 在Analysis Method欄中，選擇合適的分析方法7. 在Snp Set欄中，選擇合適的SNP8. 輸入相關(guān)的用戶自定義信息9. 在Result Group 1欄中，選擇合適的Result Group10. 在Instrument Protocol 1欄中，選擇上面創(chuàng)建的pr