荷葉黃酮類物質(zhì)的提取及其抗氧化活性的研究

1、第22卷第3期2007年9月安徽工程科技學(xué)院學(xué)報JournalofAnhuiUniversityofTechnologyandScienceVol.22.No.3Sep.,2007文章編號:1672-2477(2007)03-0024-04荷葉黃酮類物質(zhì)的提取及其抗氧化活性的研究王嵐嵐,蔡為榮,胡勇(安徽工程科技學(xué)院生物化學(xué)工程系,安徽蕪湖241000)摘要:研究了荷葉中黃酮類物質(zhì)的提取及其對豬油的抗氧化作用.首先,采用單因素實(shí)驗(yàn)法確定了從荷葉中提取黃酮類化合物的最佳五因素五水平的選擇實(shí)驗(yàn).得出最佳提取條件:以50%的乙醇作提取劑,按125的固液比,溫度為40,pH值為5.15,提取時間為90

2、min。其次,研究了提取物對豬油的抗氧化作用.將提取液以不同比例添加到豬油中,恒溫并定期用Na2S2O3-I2滴定法測油樣的過氧化值,結(jié)果表明:荷葉中黃酮類化合物對豬油有明顯的抗氧化作用,且黃酮類化合物的添加量在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)與其抗氧化性呈正相關(guān);當(dāng)添加量為0.5%時,荷葉中黃酮類化合物的抗氧化性能可與BHT相媲美;同時還研究了荷葉提取物與Vc的協(xié)同抗氧化作用,結(jié)果表明荷葉黃酮類化合物與Vc有較好的增效協(xié)同效應(yīng)。關(guān)鍵詞:荷葉;提取;黃酮;抗氧化活性中圖分類號:S645文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A荷葉系睡蓮科屬植物,生長在水、,.本草綱目載“:荷時服之,令人瘦劣,單服可以消陽水浮之氣”.脂類、蛋白質(zhì)、單寧等常

3、規(guī)化學(xué)成分外,.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,降血脂、降膽固醇及治療心腦血管疾病等藥用保健功能15,1991年116.有資料表明,荷葉的黃酮類化合物含量非常豐富7,本文研究荷葉黃酮類化合物對油脂抗氧化活性作用,以便綜合利用荷葉這一豐富資源.1實(shí)驗(yàn)部分1.1材料、試劑與儀器(1)材料:荷葉(購于安徽省蕪湖市神山口藥材店);豬油(自制).(2)試劑:亞硝酸鈉、抗壞血酸、過氧化氫、硫酸亞鐵、鉬酸鈉、氯仿、KI、冰乙酸、AlCl3、FeSO4、Na2SO3、無水乙醇、NaOH、三氯甲烷、乙醇、乙酸、硫酸鋰、鎢酸鈉、硫代硫酸鈉、碘化鉀,蘆丁(生化試劑,上海生化試劑二廠),丁基化羥基甲苯(上海益民食品廠).試劑均為分

4、析純.水為蒸餾水.(3)儀器:FC104電子天平(上海精科天平廠);酸度計(jì)(上海青浦滬西儀器廠);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠);離心機(jī)(中外合資深圳天南?；邢薰?;數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6(國華電器有限公司);721型分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司).1.2實(shí)驗(yàn)方法(1)原料的選擇與預(yù)處理.將購來的荷葉去梗后碎成片狀,大小約為10mm5mm,儲存以備用.由于市售的植物油中多含有抗氧化劑,干擾檢測,所以本實(shí)驗(yàn)選用自制的豬油為材料.按照我國豬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,豬油的過氧化值16meq/kg.(2)荷葉黃酮的提取.影響荷葉黃酮類化合物浸提效果的因素主要有五個,即提取劑的濃度、固液比、提取pH

5、、時間和溫度,為了進(jìn)一步研究這五個因素對荷葉黃酮提取率的影響,本實(shí)驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)法以提取的黃酮含量為指標(biāo)來確定最佳提取條件.其因素水平見表1.準(zhǔn)確稱取荷葉碎片5份,每份20g,分別置于250mL圓底燒瓶中.分別加入一定濃度的乙醇,于恒溫水浴鍋內(nèi)加熱回流提取數(shù)小時,過濾將濾渣用50mL同濃度的乙醇洗滌,再過濾,合并兩次濾液,將濾液在4000,收集上層清液,定容于100mL的容量瓶,放入冰箱中作為待測提取物備用.收稿日期:2007-03-12基金項(xiàng)目:安徽省教育廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2003kj037),女,安徽蕪湖人,工程師.作者簡介:王嵐嵐(1965第3期王嵐嵐,等:荷葉黃酮類物質(zhì)的提取及

6、其抗氧化活性的研究表1因素水平表25305060701101151201254.035.156.807.74609012015027406080(3)荷葉提取物中黃酮類化合物含量的測定.荷葉黃酮的含量的測定方法用NaNO2-Al(NO3)3比色法8,制作以蘆丁為黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線.精稱蘆丁0.0175g,用30%乙醇溶解定容至50mL,備用.取7支具塞試管,分別加入0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL蘆丁標(biāo)液,用30%乙醇補(bǔ)足體積至5mL,混勻器混勻,各加入0.3mL5%NaNO2,混勻后靜置5min,加0.3mL10%Al(NO3)3,混勻后靜置6min

7、,加入4mL1mol/LNaOH,再加入0.4mL30%乙醇使總體積為10mL,混勻后靜置10min,在波長510nm處測定吸光值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1).測定荷葉提取液的光密度值,上查出荷葉提取液的黃酮類化合物含量9.(4)荷葉黃酮抗氧化活性的測定.稱取3用少許60%的乙醇溶解后加入3只裝有50g豬油的100mL,.將所有試樣放入(500.5)恒溫培養(yǎng)箱中,并交換位置以確保環(huán)境條件相同.每隔幾天取樣測定豬油的過氧化值,進(jìn)而衡算提取物的抗氧化性10.精確稱取3g混勻樣品(必要時過濾),50mL乙醇-異辛烷混合液,溶解樣品,加入0.5mL飽和碘化鉀溶液,立即加塞搖勻1min,避光靜置反應(yīng)5min

8、.取出加水30mL,以0.01mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡黃色時,加入0.5mL淀粉指示劑,繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn),同時做一空白實(shí)驗(yàn),按照下式計(jì)算:POV=C(V1-V0)1000/m.式中:V1為試樣用去的Na2S2O3溶液體積;V0為空白試驗(yàn)用去的Na2S2O3溶液體積;C為Na2S2O3溶液的濃度;m為試樣的質(zhì)量.2結(jié)果與討論2.1荷葉黃酮最佳提取工藝的確定(1)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對荷葉黃酮提取率的影響.乙醇溶解性能好,穿透細(xì)胞能力強(qiáng),隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加提取率增大.當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到一定程度時,黃酮類物質(zhì)溶解度最大,即提取率最高.而后,乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)再增加,黃酮類物質(zhì)的溶解度減小,

9、同時,一些醇溶性雜質(zhì),親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加,這些成分與黃酮類物質(zhì)競爭同乙醇-水分子結(jié)合充分導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)的提取率下降.由表2可知,乙醇的最適合質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%,進(jìn)一步優(yōu)化的范圍40%60%.表2乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對荷葉黃酮提取率的影響乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%304050黃酮含量/(g100mL-1)0.01680.02240.0243乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%6070黃酮含量/(g100mL-1)0.01780.0152(2)固液比對荷葉黃酮提取率的影響.固液比實(shí)際上是溶劑用量的多少.一般來說,溶劑用量越大,提取率越大,但是,過大的固液比會造成溶劑和能源的浪費(fèi)并給后工序的濃縮帶來困難.當(dāng)固液比達(dá)到一定程度時,再增

10、大固液比,提取率趨于穩(wěn)定,即一定比例的溶劑已將有效成分基本溶出完全.由表3可得,最適料液比為125.26安徽工程科技學(xué)院學(xué)報表3固液比對荷葉黃酮類物質(zhì)提取率的影響固液比1101151202007年黃酮含量/(g100mL-1)0.00930.01030.0123固液比125130黃酮含量/(g100mL-1)0.01300.0127(3)時間對荷葉黃酮提取率的影響由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,黃酮類物質(zhì)提取率隨時間不同而不同,當(dāng)提取達(dá)到一定時間時,荷葉內(nèi)外有效成分濃度達(dá)到平衡,提取率最高.但隨著時間的進(jìn)一步延長其提取率有所下降,因?yàn)辄S酮類物質(zhì)在溶液中長時間受熱可能使部分結(jié)構(gòu)被破壞.但是,如果提取時間過短,黃

11、酮類物質(zhì)則來不及從荷葉中溶出,影響提取率.由表4可知,時間對荷葉黃酮類化合物提取率的影響并不明顯,最適時間為6090min.表4時間對荷葉黃酮提取率的影響6090(-10.02610.0278150180-10.02300.0221(4)酸堿度(pH)對荷葉黃酮提取率的影響.用緩沖液配制p為4.038、7.74、8.50的60%的乙醇溶液浸提荷葉,浸提過程中用2mol/LHCl和2LpH,使其保持不變,2h后取出趁熱過濾,濾渣用50mL60,2次濾液再抽濾.在510nm處測定其吸光值,數(shù)據(jù)見表5.,在本實(shí)驗(yàn)中,pH為5.15時在510nm,pH的范圍為5.06.0.5(pH)對荷葉黃酮提取率的

12、影響4.035.15(-10.03130.03477.748.50-10.02840.0267(5)溫度對荷葉黃酮提取率的影響.一般來說,冷提雜質(zhì)少,熱提效率高,速度快.溫度升高,分子運(yùn)動速度加快,滲透擴(kuò)散,溶解速度加快,同時,高溫可以引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化使黃酮類物質(zhì)由荷葉的外層細(xì)胞轉(zhuǎn)移到溶劑中,因此,隨著提取溫度的升高,黃酮類物質(zhì)的提取率升高.但是,高溫使黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)氧化破壞導(dǎo)致其提取率下降.溫度對荷葉黃酮提取率的影響見表6.表6溫度對荷葉黃酮提取率的影響溫度/3040/(g100mL-10.02340.027180100-10.01770.01452.2荷葉黃酮抗氧化活性的測定(1)不

13、同濃度荷葉黃酮與BHT(0.02%)對豬油的抗氧化作用的比較.可以看出,所有實(shí)驗(yàn)組的POV值均低于空白對照組的值,證明荷葉中黃酮類化合物對豬油有一定的抗氧化作用;隨著提取液濃度的增加,其對豬油的抗氧化作用增強(qiáng),兩者在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)呈正相關(guān),而且,隨著保藏時間的延長,抗氧化效果更加顯著.與BHT的最大限度添加量0.02%為對照,對豬油進(jìn)行了抗氧化性實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7.表7不同濃度提取物與BHT的抗氧化性能的比較試樣空白0.05%提取液0.2%提取液0.5%提取液2.952.952.952.955.534.533.763.02-112.1310.2410.068.8115.1613.6812.5

14、79.9320.0518.0615.4714.02由表7所示結(jié)果看,當(dāng)黃酮類化合物的添加量為0.5%時,其抗氧化作用可以與人工合成抗氧化劑BHT相媲美,這顯示了荷葉中黃酮類化合物在食用油脂抗氧化方面的巨大潛力.第3期王嵐嵐,等:荷葉黃酮類物質(zhì)的提取及其抗氧化活性的研究27(2)荷葉黃酮與Vc(11)的協(xié)同抗氧化作用.我們以抗壞血酸為增效劑,與實(shí)驗(yàn)提取物混合使用,對豬油進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn),以考察Vc對荷葉中黃酮的增效作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8.表8提取物與增效劑混合的抗氧化性能的比較(POV值/meq/kg)試樣空白0.05%提取液2.952.955.534.53-112.1310.2415.1613.6

15、820.0518.06由表8所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出,0.025%黃酮類+0.025%Vc的抗氧化作用比單獨(dú)用0.05%黃酮類對豬油的抗氧化作用強(qiáng),荷葉中黃酮類化合物與Vc結(jié)合使用對豬油有較好的協(xié)同抗氧化作用.3結(jié)論(1)通過以上單因素實(shí)驗(yàn),得出最優(yōu)化提取工藝條件為:乙醇濃度50%,固液比為125,pH值為5.15,時間為90min,溫度為40;(2)荷葉中黃酮類化合物對豬油具有一定的抗氧化作用,且隨著提取液濃度的增加,其對豬油的抗氧化作用逐漸增強(qiáng),在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)呈正相關(guān).添加0.5%黃酮類化合物的抗氧化效果可與0.02%的人工合成抗氧化劑BHT相媲美;(3)Vc結(jié)合使用對豬油有較好的協(xié)同抗氧化作用

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