ChIP實驗常見問題解析

1、ZOONBIOBIOTECHNOLOGYChip實驗常見問題解析技術(shù)服務(wù)咨詢查號撥0,（分機）分子802/蛋白803/免疫806/檢測8產(chǎn)品銷售專線司名稱南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司技術(shù)支持熱線：400-066-8086公司網(wǎng)址：郵箱：orderNO稅號:9132011656723852XA聯(lián)系地址：江蘇省南京經(jīng)濟開發(fā)區(qū)紅楓科技園A6棟2樓鐘鼎生物（郵編210033 ）Chip實驗常見問題解析I.染色質(zhì)免疫共沉淀（Chip）實驗中使用超聲方法斷裂染色 質(zhì)溫度不易控制，可能會使蛋白變性，如

2、何進行優(yōu)化？染色質(zhì)免疫共沉淀（Chip）實驗中超聲的優(yōu)化一般從如下幾個方而考 慮：（1）重復已發(fā)表文獻中的剪切方案時建議進行優(yōu)化。尤其是當儀器不同于文獻中所使用的儀器時。（2）使用基于探頭的超聲破碎儀時，探頭要適于樣品體積。（3）在任何情況下， 剪切參數(shù)都應(yīng)當根據(jù)樣品體積、 細胞密度和細 胞類型而優(yōu)化。（4）優(yōu)化應(yīng)當包括功率設(shè)置（超聲時間vs.間隙時間/休息時間） 以及獲得長度為200 - 1000 bp的DNA片段所需的剪切循環(huán)數(shù)，每 個優(yōu)化實驗只優(yōu)化一種參數(shù)；（5）注意時間和功率設(shè)置。過度破碎和太高功率設(shè)置會損害在免疫沉淀步驟中的表位。降低染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）信號。（6）始終保持裂

3、解液冰冷，間斷超聲（而非連續(xù)），因為超聲處理 產(chǎn)生熱量會使染色質(zhì)變性。（7）在超聲破碎過程中避免氣泡。 泡沫會導致蛋白質(zhì)的表而變性，可能使染色質(zhì)損失在氣泡中。為了避免這種情況，一開始設(shè)為較低功 率，再逐步提高。（8）在優(yōu)化條件時，每個超聲破碎循環(huán)后通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA片段的長度。 剪切不足所產(chǎn)生大的不溶復合物可能堵塞瓊脂糖凝 膠的孔，并延緩電泳過程。通過消化蛋白質(zhì)、逆轉(zhuǎn)交聯(lián)、酚:氯仿提 取和沉淀來純化DNAo2染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實驗研究轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控因子結(jié)合的DNA和組蛋白結(jié)合的DNA操作上最大的區(qū)別是什么？染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實驗中由于組蛋白在染色質(zhì)中表達相對較 高

4、且較穩(wěn)定，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子表達水平很低，往往是瞬時表達。所以組 蛋白相對研究起來更為容易，一般需要105-106個細胞即可完成一個 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）反應(yīng)。研究起始樣本量（細胞，組織）要 是組蛋白的10倍，一般每個反應(yīng)至少需要107個細胞。另外有些轉(zhuǎn) 錄因子比較大，往往結(jié)合多個核小體，因此在染色質(zhì)斷裂的時候，不 太適合使用酶法的處理方式， 建議使用超聲斷裂染色質(zhì)的方法。 因為 酶法是化學處理，消化的位點往往比較均一，多是在核小體的連接處, 酶消化有可能將核小體斷裂的同時打斷轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合。3染色質(zhì)為什么要片段化？片段化的長度為什么是200-1000?片段化過度或不足對實驗會有什么

5、影響?片段化的目的是確保高分子量染色質(zhì)的蛋口質(zhì)/DNA復合物是可溶的, 能被ChIP抗體接近；為確保染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實驗有良好 精度，一般片段化的大小在200-1000bp,一般300-600bp均能獲得 較好的ChIP結(jié)果。如果小于200bp的話，蛋白的結(jié)合位點很有可能 被打斷，原因是由于每個核小體結(jié)合DNA的序列長度為175bp,加上 不同核小體間的linker DA序歹lj,這樣每個核小體結(jié)合DNA的最小 序列大概在200bp左右，如果片段長度大于lOOObp，您將會分離獲 得包含目標序列的DNA,但所要研究的蛋白可能會離您目標序列有700個核苗酸的距離；如果過度片段化可能破

6、壞抗原表位降低PCR效 率，片段化不全導致樣木丟失，可能會獲得假陰性結(jié)果。4在免疫沉淀的時候，樣本，抗體和磁珠加樣和反應(yīng)順序?qū)嶒灲Y(jié)果有什么影響？有要求嗎？一般有3種反應(yīng)順序：染色質(zhì)樣本+抗體先反應(yīng)，然后加磁珠；抗體+磁珠先反應(yīng)，然后加染色質(zhì)抗體；染色質(zhì)樣木+抗體+磁珠 三者同時 反應(yīng)。無論選擇哪種微珠，使用磁珠或瓊脂糖珠的順序可能影響您 的ChIP信號。第一種方法先將微珠與捕獲抗體共同孵育（室溫下幾 小時，或4。C過夜），接著加入染色質(zhì)（樣本），繼續(xù)孵育（4。C震 蕩孵育1小時至過夜）。增加孵育時間有可能增加背景和ChIP信號;然而，與靶點親和力低的抗體即使延長（過夜）孵育，也不產(chǎn)生明顯 的

7、ChIP信號。第二種方法將抗體與染色質(zhì)樣本先共同孵育，再加入微珠也能獲得和第一種反應(yīng)順療湘似的結(jié)果，均能較好的進行免疫沉 淀反應(yīng)。但是不建議同時加入這三個組分進行免疫沉淀反應(yīng)，有實驗驗證顯示 同時加入三個組分雖然能減少開展整個反應(yīng)所需的時間，但是和上述 兩種方法相比，結(jié)果較差。5染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實驗中最關(guān)鍵的結(jié)果是什么？什么樣的富集倍數(shù)被認為是陽性的結(jié)果？染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實驗?zāi)旧砥鋵嵕褪且粋€通過免疫沉淀反應(yīng) 驗證蛋口與DNA相互作用的實驗。因此結(jié)果一般包括兩個數(shù)據(jù)：免疫 沉淀的效率（富集效率）,蛋口與DNA結(jié)合能力（富集倍數(shù)）。但是 這兩個結(jié)果木身都是一個相對值，因為富

8、集效率就是斷裂后的染色質(zhì) 分成兩部分，一部分進行免疫沉淀，一部分作為對照不進行免疫沉淀, 然后兩者進行比較，得到一個百分比。富集倍數(shù)就是取兩個抗體進行 免疫沉淀，一個是特異性的抗體，另一個是陰性抗體（和特異性抗體 同種屬的IgG）驗證抗體是否有非特異性的結(jié)合，然后將這兩個抗體 獲得的DNA進行比較，得到一個比值。因此無論是富集效率還是富集 倍數(shù)其實都只是一個相對的結(jié)果，沒有特定的數(shù)值，富集倍數(shù)的高低 往往取決于蛋口質(zhì)靶點的豐度，相對于低豐度的靶點，高豐度靶點有 可能產(chǎn)生高的富集。一些實驗室將相對于IgG對照的5倍富集設(shè)為成 功實驗的最低閾值。不過，最好將結(jié)果與己發(fā)表的結(jié)果比較，而不是 固守設(shè)定值。6. ChIP實驗中DNA的檢測在什么情況下用PCR反應(yīng)？什么情況下用測序？當我們己知蛋口結(jié)合的DNA序列的時候， 可以使用PCR反應(yīng)進行檢測,PCR可以使用End point PCR和Q-PCR方法，在PCR的時候除了樣本 組外，還需要設(shè)置input對照，陰性對照和空白對照。PCR擴增片段 長度200-400bp最佳，模板DA片段過長，結(jié)合位點的鄰近DNA會出 現(xiàn)一定程度的信號富集。但是有些情況下， 蛋白結(jié)合的DNA序列是未知的， 這時我們需要使用ChIP結(jié)合測序(Seq)方法檢測，染色質(zhì)免疫共沉淀測序(ChlP-Seq)一般包括3個步驟：染色質(zhì)