實驗二-培養(yǎng)細胞的觀察和檢測方法(共4頁)

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上實驗二 培養(yǎng)細胞的觀察和檢測方法一、 細胞計數法 細胞計數法（cell counting）是用來計數細胞懸液中細胞數量的一種方法。一般利用細胞計數板(即血細胞計數板)進行。既可用于分散)細胞培養(yǎng)接種前計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，也可用于對培養(yǎng)物的細胞數量進行計數。不論計數的對象如何，均須制備分散的細胞懸液。（一）制備細胞懸液 原代培養(yǎng)前用機械或化學方法分散組織成為單個細胞懸液。對于懸浮培養(yǎng)的細胞，可直接進行下面的步驟進行計數。如果計數對象為貼壁生長的細胞，首先需將培養(yǎng)物制備成細胞懸液。步驟如下：1) 終止培養(yǎng)，將培養(yǎng)液吸出，用PBS洗培養(yǎng)物一次。2) 給培養(yǎng)瓶內

2、加入1m1 0.25胰蛋白酶溶液，于37消化35 min，期間不斷在鏡下觀察。當細胞變圓接近脫壁時，棄消化液。3) 加人一定量的培養(yǎng)液(如果這些培養(yǎng)細胞不再有用，可加PBS)，用吸管吹打，使細胞脫壁而制成細胞懸液。(二) 計數與計算過程1) 在細胞計數板中央放置計數專用的蓋玻片。2) 用玻璃虹吸管吸取細胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側的計數板凹槽處流出懸液，至蓋玻片下被液體充滿為止。3) 置顯微鏡下計數四角大方格內的細胞總數。對于壓線的細胞只計數在上線和左線者，對于細胞團按實際或估計細胞計數。4) 按下式計算細胞懸液的密度：細胞密度(4大格細胞總數4)x 10000(個ml)二、活細胞的染料排除檢

3、測法由于死細胞的細胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進入卻不被排出，因而細胞呈色。而活細胞反之，能排出進入細胞內的染料，因而不易著色。此法的原理即是利用死、活細胞對染料的不同反應而區(qū)分開兩種細胞，可進一步分別計數。（一） 臺盼藍排除檢測法1. 2臺盼藍溶液的配制：稱取2g臺盼藍(trypan blue)，加少量雙蒸水研磨粉碎后，再加水至50m1，離心后取上清液，再加入1.8NaCl溶液至100 m1，即成工作液。2. 活體染色與細胞計數：l 將1滴細胞懸液(貼壁細胞可經0.25胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成細胞懸液)與2滴臺盼藍液混合后，滴入細胞計數板。l 2 min后，在顯微鏡下計數至少200

4、個細胞。未著色的為活細胞，呈藍色的為死細胞。計算活細胞百分比。（二） 溴比乙錠和碘化丙錠排除檢測法溴比乙錠（ethidiumbromide，EB）和碘化丙錠（propidium iodine，PI）均為熒光染料，可與DNA特異性結合。1. 染液配制：取EB或P1 5 mg，枸櫞酸鈉0.1g，NP-40 0.3 ml，共溶于100ml蒸餾水中。避光保存。2. 熒光染色與計數：取細胞懸液和EB或PI染液各0.5ml，混勻。靜置10-30min后于熒光顯微鏡下計數。發(fā)橙紅色熒光者為死細胞。也可用流式細胞儀測定，激發(fā)光波長為488 nm。2h內熒光保持穩(wěn)定。三、細胞活力測定的MTT比色法此法的原理是活

5、細胞的線粒體脫氫酶能將染料MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽）轉變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙篆仯╢ormazan）顆粒，后者被二甲基亞砜（dimethylsulfoxide, DMSO）或酸性異丙醇溶解后所呈現(xiàn)的色度（用OD值表示）反映出生活細胞的代謝水平。死亡細胞則無此酶活性。1. MTT溶液的配制：將5 mg MTT溶于1 m1培養(yǎng)液(與所培養(yǎng)細胞用液相同，不含酚紅)、0.01 molL PBS （pH 7.2）或生理鹽水中。用0.2 m濾膜過濾。于4避光保存?？捎?周。若暫不用，可凍存。2. 實驗過程：1) 將細胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板。實驗時每孔含180 l培養(yǎng)液。2) 加入20 l MTT液，繼續(xù)

6、培養(yǎng)34h。3) 吸去培養(yǎng)液，加入200 l含0.040.1 molL鹽酸的異丙醇溶液二甲基亞砜（DMSO）。在微型振蕩器振蕩5 min。4) 在酶標儀上測定光吸收。測定波長為490或570 nm。四、普通染色觀察蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和Giemsa染色是觀察培養(yǎng)細胞一般形態(tài)的最常用方法，也是把細胞作為標本保存的主要方法。對于貼壁培養(yǎng)的細胞，以生長于蓋玻片和塑料培養(yǎng)瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks液、PBS、BSS或生理鹽水清洗培養(yǎng)物2次，去除妨礙染色的血清。固定后可將蓋玻片用樹膠貼于載玻片上，以利操作。對于懸浮培養(yǎng)細胞，須先經離心沉淀(1000 rp

7、m，10 min)，棄上清液后(留少量液體)，將細胞懸液滴于玻片上做成涂片，冷風吹干。（一）HE染色1. 染液配制：1) 蘇木精染液：稱取0.5 g 蘇木精，5.0 g鉀礬，0.1 g碘酸鈉加溫溶于70 ml蒸餾水。再加入30 m1甘油，2 ml冰醋酸?；靹颉＿^濾后即成母液, 可長久保存。用蒸餾水以1:20稀釋即成工作液。每次染色前宜過濾，去除氧化膜。2) 伊紅染液：伊紅有醇溶性與水溶性之分。將0.5 g伊紅溶于100 ml 70乙醇或蒸餾水即成工作液。2. 染色程序:1) 用10甲醛(福爾馬林)固定培養(yǎng)物30 mim，或以丙酮固定15 mim。2) 蒸餾水洗1次后，入蘇木精染液510 min

8、染細胞核。3) 入0.5鹽酸70乙醇溶液1 min，脫去胞質的著色。此時核呈紫紅色。4) 入堿性溶液堿化，使細胞核變成藍色。如果時間允許，最好用自來水(呈弱堿性)長時間浸泡。也可1NaHCO3溶液。此過程須不斷用顯微鏡監(jiān)視，以掌握堿化時間。5) 蒸餾水洗1 min，去除殘留的堿性溶液，否則影響伊紅著色。6) 入伊紅染液30s1 min。7) 用梯度乙醇溶液脫水：70、90、95乙醇各30 s1 min；100(2次)各2 min。如伊紅為乙醇溶液，則略去70%乙醇。8) 用二甲苯透明2次，各5 min。9) 樹膠封固。3. 染色結果：細胞核呈紫藍色或深藍色，大部分細胞的胞質呈粉紅色。如果胞質內

9、含較多核糖體(例如淋巴細胞)則亦呈藍色。（二）吉姆薩 (Giemsa) 染色法此法可將細胞核與胞質同時染色，故便捷快速；但染液配制技術不易準確掌握，效果常不如HE染色穩(wěn)定。1. 吉姆薩染液的配制：1) 取1.5g吉姆薩粉末放入50 ml甘油，置于60溫箱，約3h后溶解。2) 取出后倒人50 ml中性甲醇，即為母液。于棕色瓶可長久保存。需要注意的是，有的甲醇內含醋酸，會使染液中的伊紅沉淀出來，不利染色。3) 將母液與0.1mol/L PBS(pH6.9-7.2)按1:9混合即成工作液。吉姆薩染液對pH極敏感，偏酸時染色過紅，偏堿時則過藍。所以，工作液宜現(xiàn)用現(xiàn)配，保存時間不超過48h以免被CO2酸

10、化。2染色程序：1) 將標本用甲醇固定510 min。2) 入吉姆薩液染色1015 min?？捎萌旧祝驅⑷疽旱胃灿跇吮?。3) 蒸餾水清洗，空氣干燥，二甲苯透明，樹膠封固。3染色結果：細胞核呈藍或藍紫色，胞質呈色與HE染色相仿。五、免疫細胞化學1. 培養(yǎng)的細胞用0.1 mol/L的PBS緩沖液（pH 7.27.4）洗15 min（5 min × 3次）；2. 用4多聚甲醛固定液固定20 min，晾干；3. 3%H2O2孵育20 min滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗，0.1 mol/L的PBS緩沖液浸泡10 min；4. 滴加山羊血清封閉液，室溫20 min，吸去多余液體，不洗；5. 滴加第一抗體，4過夜后用PBS緩沖液洗5 min × 3次；6. 滴