微生物的大小及數(shù)量的測(cè)定

1、微生物試驗(yàn)報(bào)告微生物的大小及數(shù)量的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解顯微鏡測(cè)定微生物大小與血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物數(shù)量的原理。2. 學(xué)習(xí)并掌握顯微鏡下測(cè)定微生物細(xì)胞大小的技術(shù)，包括目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè) 微尺的校正技術(shù)與測(cè)定細(xì)胞大小的技術(shù)。3. 了解血球計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)，學(xué)習(xí)并掌握血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)微生物數(shù)量的技術(shù)，包 括樣品的點(diǎn)樣、菌數(shù)計(jì)數(shù)的方法與計(jì)算。二、實(shí)驗(yàn)原理1 .微生物大小測(cè)定原理微生物細(xì)胞的大小，是微生物重要的形態(tài)特征之一，也是分類鑒定的依據(jù)之 一。由于菌體很小、只能在顯微鏡下來(lái)測(cè)量。用于測(cè)量微生物細(xì)胞大小的工具有 目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺。（1）目鏡測(cè)微尺（圖1）目鏡測(cè)微尺是一塊圓形玻片，在玻片中央把 5

2、m求度亥ij成50等分，或把 10 mmfe度亥I成100等分。測(cè)量時(shí)，將其放在接目鏡中的隔板上 （此處正好與物 鏡放大的中間像重疊）來(lái)測(cè)量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象。由于不同目鏡、物鏡 組合的放大倍數(shù)不相同，目鏡測(cè)微尺每格實(shí)際表示的長(zhǎng)度也不一樣，因此目鏡 測(cè)微尺測(cè)量微生物大小時(shí)須先用置于鏡臺(tái)上的鏡臺(tái)測(cè)微尺校正，以求出在一定 放大倍數(shù)下，目鏡測(cè)微尺每小格所代表的相對(duì)長(zhǎng)度。圖1目鏡測(cè)微尺圖2鏡臺(tái)測(cè)微尺（2）鏡臺(tái)測(cè)微尺（圖2）鏡臺(tái)測(cè)微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般將lmm等分為100格，每格長(zhǎng)10 pm（即0.0lmm）,是專門用來(lái)校正目鏡測(cè)微尺的。校正時(shí)，將 鏡臺(tái)測(cè)微尺放在載物臺(tái)上，由于

3、鏡臺(tái)測(cè)微尺與細(xì)胞標(biāo)本是處于同一位置，都要 經(jīng)過(guò)物鏡和目鏡的兩次放大成象進(jìn)入視野，即鏡臺(tái)測(cè)微尺隨著顯微鏡總放大倍 數(shù)的放大而放大，因此從鏡臺(tái)測(cè)微尺上得到的讀數(shù)就是細(xì)胞的真實(shí)大小，所以 用鏡臺(tái)測(cè)微尺的已知長(zhǎng)度在一定放大倍數(shù)下校正目鏡測(cè)微尺，即可求出目鏡測(cè) 微尺每格所代表的長(zhǎng)度，然后移去鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上待測(cè)標(biāo)本片，用校正好的 目鏡測(cè)微尺在同樣放大倍數(shù)下測(cè)量微生物大小。2 .血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物數(shù)量的原理鏡檢計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)常不 易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球計(jì)數(shù)板；一般細(xì)菌則采用彼得 羅夫霍澤（Petroff Hausser） 細(xì)菌計(jì)數(shù)板。兩種

4、計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只 是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，故 細(xì)菌不易看清。血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有 4條槽而構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中 間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)方格網(wǎng) （圖3）。每個(gè)方格網(wǎng)共分9大格，其中間的一大格（又稱為計(jì)數(shù)室）常被用作微生 物的計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又 分成16個(gè)小方格。但是不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同特點(diǎn)，即 每個(gè)大方格都由400個(gè)小方格組成（圖4）。每個(gè)大方格

5、邊長(zhǎng)為1mm則每一大方格的面積為1mrh每個(gè)小方格的面積為 1/400mm蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計(jì)數(shù)室底部之間的高度為 0.1mm所以每個(gè) 計(jì)數(shù)室（大方格）的體積為0.1mm,每個(gè)小方格的體積為l /4000mim使用血球計(jì) 數(shù)板直接計(jì)數(shù)時(shí)，先要測(cè)定每個(gè)小方格（或中方格）中微生物的數(shù)量，再換算成每 毫升菌液（或每克樣品）中微生物細(xì)胞的數(shù)量。圖3血球計(jì)數(shù)扳的構(gòu)造a.平面圖（中間平臺(tái)分為兩半，各半邊有一個(gè)方格網(wǎng)）b.側(cè)面圖（中間平臺(tái)與蓋玻片之間有高度為 0.1毫米的間隙）圖4血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)網(wǎng)的分區(qū)和分格三、實(shí)驗(yàn)材料1 .儀器顯微鏡，目鏡測(cè)微尺，鏡臺(tái)測(cè)微尺，血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片（22m忤22mm、吸水

6、紙、計(jì)數(shù)器、滴管、擦鏡紙，酒精燈2 .材料酵母菌液，枯草芽抱桿菌斜面培養(yǎng)物3 .試劑美蘭染液，結(jié)晶紫，蒸儲(chǔ)水等四、實(shí)驗(yàn)方法1. 目鏡測(cè)微尺的校正把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測(cè)微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上， 把鏡臺(tái)測(cè)微尺置于載物臺(tái)上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對(duì)準(zhǔn)焦距，視野中看 清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行， 移 動(dòng)推動(dòng)器，使兩尺重疊，再使兩尺的“ 0”刻度完全重合，定位后，仔細(xì)尋找兩 尺第二個(gè)完全重合的刻度，計(jì)數(shù)兩重合刻度之間目鏡測(cè)微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測(cè)微尺 的格數(shù)。因?yàn)殓R臺(tái)測(cè)微尺的刻度每格長(zhǎng)10 pm,所以由下列公式可以算出目鏡測(cè) 微尺每格所代表的長(zhǎng)度

7、。目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度（卜m）兩重合線間鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù) X 10兩重合線間目鏡測(cè)微尺的格數(shù)用此法分別校正在物鏡倍數(shù)為10X, 40X, 100X下目鏡測(cè)微尺每小格所代 表的長(zhǎng)度。注意事項(xiàng)6由于不同顯微鏡及附件的放大倍數(shù)不同，因此校正目鏡測(cè)微尺必須針對(duì)特定 的顯微鏡和附件（特定的物鏡、目鏡、鏡筒長(zhǎng)度）進(jìn)行，而且只能在特定的情況 下重復(fù)使用，當(dāng)更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)， 必須重新校正目鏡測(cè)微尺每 一格所代表的長(zhǎng)度。2. 細(xì)胞大小的測(cè)定A.酵母菌的大小測(cè)定1）取一滴酵母菌菌懸液制成水浸片。2）移去鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上酵母菌水浸片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高 倍鏡下用目鏡測(cè)微尺來(lái)測(cè)量酵母菌菌體

8、的長(zhǎng)， 寬各占幾格（不足一格的部分估計(jì) 到小數(shù)點(diǎn)后一位數(shù)）。測(cè)出的格數(shù)乘上目鏡測(cè)微尺每格的校正值，即等于該菌的長(zhǎng)和寬。B.枯草芽抱桿菌的大小測(cè)定1）將載玻片洗凈晾干后，在其中央滴一滴蒸儲(chǔ)水，然后通過(guò)無(wú)菌操作用接種針 取少量枯草芽抱桿菌的斜面培養(yǎng)物于蒸儲(chǔ)水中，然后干燥2）單染色用結(jié)晶紫染液或美蘭染液對(duì)其進(jìn)行單染色，染色一定時(shí)間后沖洗載玻片的背 面，將染液沖洗掉3）置于顯微鏡下鏡檢，用目鏡測(cè)微尺測(cè)量枯草芽抱桿菌的長(zhǎng)和寬注意事項(xiàng)測(cè)量菌體大小時(shí)要在同一個(gè)標(biāo)本片上測(cè)定 3個(gè)大小相近的菌體，求出平均值, 才能代表該菌的大小。而且一般是用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體進(jìn)行測(cè)定。3. 酯母菌菌懸液中酯母菌菌數(shù)的測(cè)定（1）取

9、潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)室上蓋上一塊蓋玻片。（2）將酵母菌菌懸液充分搖勻，用滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽 內(nèi)沿蓋玻片的右上角滴入一小滴（不宜過(guò)多），使菌液沿兩玻片間自行滲入計(jì)數(shù)室， 勿使產(chǎn)生氣泡，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌液。（3）先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)室后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察計(jì)數(shù)。（4）計(jì)數(shù)時(shí)用16中格的計(jì)數(shù)板，要按對(duì)角線方位，取左上、左下、右上、右下的 4個(gè)中格（即100小格）的酵母菌數(shù)。如果是25中格計(jì)數(shù)板。除數(shù)上述四格外， 還需數(shù)中央1中格的酵母菌數(shù)（即80小格）。由于菌體在計(jì)數(shù)室中處于不同的空 間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而觀察時(shí)必須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)螺旋， 方能

10、 數(shù)到全部菌體，防止遺漏。如菌體位于中格的雙線上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線， 數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。（5）凡酵母菌的芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算。每個(gè)樣品重復(fù)分?jǐn)?shù)2-3次（每次數(shù)值不應(yīng)招差過(guò)大，否則應(yīng)重新操作），取其平均值，按下 述公式計(jì)算出每毫升菌液所含酵母菌細(xì)胞數(shù)（25中格）。%十及十為十Xi十范醒母H細(xì)胞數(shù)/mL= 上25（或ItT） 10 xlOOD x稀釋倍數(shù)5（6）血球計(jì)數(shù)板用后，在水龍頭上用水柱沖洗干凈，可以用去污粉洗凈，切勿用 硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或吹風(fēng)機(jī)吹干。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、目鏡測(cè)微尺的標(biāo)定結(jié)果物鏡倍數(shù)（目鏡均為10倍）目鏡測(cè)

11、微尺的格數(shù)（小格）鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)（小格）目鏡測(cè)微尺的每格的 長(zhǎng)度（m m）10倍10051.85.1840倍10012.71.27100倍1005.10.512、酵母菌的大小測(cè)定結(jié)果（10X 100）菌號(hào)123平均值目鏡測(cè)微尺的格數(shù)（小格）長(zhǎng)軸13121212.33短軸99109.33酵母大小平均值=6.29 （長(zhǎng)軸）X 4.76 （短軸）m m23、枯草芽抱桿菌大小測(cè)定結(jié)果（10X100）菌號(hào)123平均值目鏡測(cè)微尺的格數(shù)長(zhǎng)軸8787.67（小格）短軸1121.33枯草芽抱桿菌大小平均值=3.91 （長(zhǎng)軸）x 0.68 （短軸）m m24、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌懸液計(jì)數(shù)結(jié)果實(shí)驗(yàn)次數(shù)各中格中菌數(shù)

12、總菌數(shù)稀釋倍數(shù)平均值菌數(shù)（個(gè)/mL）14748393230196539.24.90 X 107六、實(shí)驗(yàn)分析在目鏡測(cè)微尺矯正的時(shí)候，不同的倍數(shù)需要分別矯正。但是也正是由于放大 的倍數(shù)不一樣，是使在矯正的時(shí)候鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度線不斷放大，也為最終的讀數(shù)帶來(lái)了一定的誤差。因?yàn)榉糯蟮谋稊?shù)越高，測(cè)量的越精確。所以用100倍物鏡 測(cè)得的應(yīng)該是最準(zhǔn)確的。其中酵母菌大小的參考值為：1-5微米X 5-30微米；枯 草芽抱桿菌的大小的參考值為：細(xì)胞 0.7-0.8 微米X 2-3微米，芽抱0.6-0.9 微米X1.0-1.5微米。測(cè)得值均在參考值的范圍內(nèi)。在對(duì)酵母菌菌懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，第一次我們觀察到每格中的菌數(shù)過(guò)多， 應(yīng)該 控制在5-10/小格，所以我們將菌懸液稀釋 5倍后再用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行技術(shù)， 所得每小格中的菌數(shù)在正好在做要求的范圍內(nèi)，這樣對(duì)于計(jì)數(shù)既準(zhǔn)備又方便。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能在操作方面出現(xiàn)失誤，如滴加菌懸液的時(shí)候和壓片的時(shí)候。但是總體來(lái)說(shuō)，結(jié)果應(yīng)該還是不錯(cuò)的。七、實(shí)驗(yàn)小結(jié)由于不同顯微鏡及附件的放大倍數(shù)不同，因此校正目鏡測(cè)微尺必須針對(duì)特定 的顯微鏡和附件（特定的