毒理學(xué)指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)操作匯總

1、藥物毒性試驗(yàn)指標(biāo)1.急性毒性試驗(yàn)一、半數(shù)致死量（LD50）的測(cè)定（一）目的:觀察受試物一次給予動(dòng)物后，所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和死亡情況。（二）動(dòng)物分組和劑量1 .動(dòng)物：一般用小白鼠8周齡，體重18-22g（同次試驗(yàn)體重相差不超過 2g）大白鼠68周 齡,體重120-150g,同次試驗(yàn)體重相差不超過 10g。2 .受試物：溶于水的做成溶液，不溶于水的做成混懸液（三）試驗(yàn)方法1 .劑量:一般選用3 5個(gè)劑量，各劑量間劑距根據(jù)受試物情況和預(yù)試結(jié)果而定。2 .給藥途徑和容積：給藥途徑：應(yīng)與臨床試驗(yàn)的途徑相一致。口服藥物應(yīng)灌胃給藥，一、二類新藥應(yīng)采用兩 種途徑給藥，其中一種應(yīng)為推薦臨床研究的給藥途徑。水溶性好

2、的藥物還應(yīng)測(cè)定靜脈給藥的急性毒性。給藥容積：小白鼠禁食（1216小時(shí)），不禁水，按體重計(jì)算：灌胃（ig）不超過0.4ml/ 10g體 重。大白鼠禁食（1216小時(shí)），不禁水、灌胃（ig）,不超過3ml/只。3 .測(cè)定LD50：將動(dòng)物按體重隨機(jī)分組，每組至少10只（雌雄各半）。給受試物后立即觀察動(dòng)物反應(yīng)情況，每天觀察一次連續(xù)觀察七天。詳細(xì)逐天記錄動(dòng)物毒性反應(yīng)情況及死亡分布， 并用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法（申報(bào)時(shí)應(yīng)說明方法名稱）計(jì)算出LD50值及95%可信限。4 .觀察毒性反應(yīng)：給受試物后應(yīng)嚴(yán)密觀察反應(yīng)情況，并記錄動(dòng)物的外觀、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、食欲（飼料消耗量卜大、小便及其顏色、被毛、膚色、呼吸、鼻、眼

3、、口腔有無異常 分泌物，體重變化以及死亡等情況。死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)進(jìn)行尸檢，發(fā)現(xiàn)病變器官應(yīng)做病理組織學(xué)檢查。若發(fā)現(xiàn)中毒反應(yīng)或死亡率一與動(dòng)物的性別有明顯相關(guān)時(shí)，則應(yīng)選擇性別敏感的動(dòng)物進(jìn) 行復(fù)試。（四）試驗(yàn)報(bào)告和結(jié)果評(píng)價(jià)應(yīng)詳細(xì)具體，包括試驗(yàn)日期、動(dòng)物的規(guī)格、性別、數(shù)量、受試物來源及含量、 試驗(yàn)方法。 LD50值及其95%可信限，以及各劑量組的死亡率，或最大耐受量的值及其相當(dāng)于臨床劑量的 倍數(shù).詳細(xì)報(bào)告實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物出現(xiàn)的中毒表現(xiàn)及致死癥狀，綜合評(píng)價(jià)受試物毒性大小。二、最大耐受量（MTD）的測(cè)定方法：受試物可用臨床試驗(yàn)的給藥途徑，以動(dòng)物能耐受的最大濃度，最大容積的劑量一次或一日內(nèi)23次給予動(dòng)物（小白鼠至

4、少20只，雌雄各半）。連續(xù)觀察七天，記錄動(dòng)物反應(yīng)情 況，以不產(chǎn)生死亡的最大劑量為最大耐受量。計(jì)算出總給予藥量 g/Kg（合生藥量g/Kg表示）,推算出相當(dāng)于臨床用藥量的倍數(shù)。測(cè)定最大耐受量，同樣也應(yīng)嚴(yán)密觀察動(dòng)物毒性反應(yīng)情況，要求與觀察單次給藥的毒 性反應(yīng)相同。2.長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)一、大鼠的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)（一）目的:觀察連續(xù)重復(fù)給予受試物對(duì)大鼠所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，首先出現(xiàn)的癥狀和嚴(yán)重程度，毒副反應(yīng)的靶器官及其恢復(fù)和發(fā)展情況。 確定無毒反應(yīng)劑量， 為擬定人用安全劑量提 供參考。（二）動(dòng)物和材料1 .動(dòng)物健康大白鼠（參見總則要求），每組至少20只。如試驗(yàn)周期為三個(gè)月以上，應(yīng)根據(jù)需要增加數(shù)量至每組 3040只

5、。體重差異應(yīng)不超過平均體重的20%。試驗(yàn)期在三個(gè)月內(nèi)用6 8周齡大鼠。超過三個(gè)月。宜用5 6周齡大鼠，雌雄各半、隨機(jī)分組，每籠不超過5只， 雌雄分籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)前至少觀察一周，記錄食量和體重等。（三）試驗(yàn)方法1 .劑量和分組（1） 一般設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組。高劑量組原則上要求使動(dòng)物產(chǎn)生明顯的或嚴(yán)重的 毒性反應(yīng)，或個(gè)別動(dòng)物死亡。中劑量組應(yīng)相當(dāng)于藥效學(xué)試驗(yàn)的高劑量.低劑量組略高于動(dòng)物的有效劑量而不出現(xiàn)毒性反應(yīng)。（2）如果急性毒性試驗(yàn)結(jié)果毒性很低，測(cè)不出LD5。也未見明顯毒性反應(yīng)，可設(shè)高、低兩個(gè)劑量組，高劑量組一般為擬用于臨床劑量50倍以上（有困難時(shí)，可適當(dāng)減少劑量 ）并應(yīng)高于藥效學(xué)試驗(yàn)之高劑量。

6、（3）對(duì)照組白設(shè)置：如受試物為提取物（如浸膏），對(duì)照物可考慮用常水；如含溶媒，對(duì)照物 為溶媒；如含賦形劑，則對(duì)照物用賦形劑。如溶媒或賦形劑可能產(chǎn)生毒性時(shí)，則應(yīng)另加一空 白對(duì)服組（常水）。2 .給藥途徑與方法（1）給藥途徑與推薦臨床的途徑一致?？诜幬飸?yīng)經(jīng)口給藥。臨床用藥途徑為靜脈注射 時(shí)，可用其它適宜的注射途徑代替。（2） 口服藥大鼠一般用灌胃法，也可將受試物混在飼料、水中給予，但每只動(dòng)物分籠飼 養(yǎng)，采取適當(dāng)措施，保證每只動(dòng)物按規(guī)定劑量在一定時(shí)限內(nèi)服入。（3）受試物最好是每周 7天連續(xù)給予，如試驗(yàn)周期在 90天以上，可考慮每周給藥6天,每天定時(shí)給藥。（4）給藥容量一般為1 2ml/1100g體

7、重，每周可根據(jù)體重情況調(diào)整給藥量，但總量不宜 超過5ml /鼠/次。各劑量組用等容量不等濃度給藥。3.試驗(yàn)周期（1）長(zhǎng)毒試驗(yàn)的給藥時(shí)間應(yīng)為臨床試驗(yàn)用藥期的二三倍，最長(zhǎng)半年。（2）若臨床用藥周期在1周以內(nèi)者，長(zhǎng)毒試驗(yàn)應(yīng)為2周;2周以內(nèi)者，應(yīng)為四周；四周以上者，長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的給藥期一般為臨床試驗(yàn)用藥期的兩倍以上。（四）檢查項(xiàng)目1 .一般觀察：進(jìn)食量、體重、外觀體征和行為活動(dòng)、糞便性狀等，發(fā)現(xiàn)有中毒反應(yīng)的動(dòng) 物應(yīng)取出單籠飼養(yǎng)，重點(diǎn)觀察。發(fā)現(xiàn)死亡或?yàn)l死動(dòng)物應(yīng)及時(shí)尸檢。2 .檢測(cè)項(xiàng)目；（1）血液學(xué)指標(biāo)：紅細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類、血小 板計(jì)數(shù)、凝血時(shí)間。（2）血液生化學(xué)指標(biāo)

8、：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（AST卜丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（ALT）堿性磷酸酶 （ALP卜尿素氮（BUN）,總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血澹（GLU卜總膽紅素（T-BIL卜肌醉（Grea）、 總膽固醇（T-CHO）。（3）系統(tǒng)尸解和病理組織學(xué)檢查：系統(tǒng)尸解：應(yīng)全面細(xì)致，發(fā)現(xiàn)異常器官應(yīng)重點(diǎn)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。臟器稱重和勝器系數(shù)；剖解后取出心、肝、腎、脾、肺、腎上腺、甲狀腺、攀丸、卵巢、 子宮、腦、前列腺。病理組織學(xué)檢查：高劑量組對(duì)照組動(dòng)物及尸檢發(fā)現(xiàn)異常器官檢查要詳細(xì)。其他劑量組可取材保存。在高劑量組發(fā)現(xiàn)有異常病變時(shí)才進(jìn)行檢查。檢查內(nèi)容除一類其他各類新藥：心、肝、腎、脾、肺、腎上腺、甲狀腺、胃、胸腺、

9、肇丸 （和附肇）Y 前列腺、卵巢和子宮和可能的靶器官。3 .可逆性觀察最后一次給藥后24小時(shí)，每組活殺部分動(dòng)物（2/3 1/2）,檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，余下動(dòng)物停 藥，繼續(xù)觀察2 4周。如24小時(shí)后的病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)有異常變化， 應(yīng)將余下動(dòng)物活殺剖檢， 重點(diǎn)觀察毒性反應(yīng)器官，以了解毒性反應(yīng)的可逆程度和可能出現(xiàn)的遲緩性毒性。4 .指標(biāo)觀察時(shí)間一般狀況和癥狀的觀察，每天觀察一次。每周記錄飼料消耗和體重一次。試驗(yàn)周期在 三個(gè)月以內(nèi)的，一般在最后一次給藥后24小時(shí)和恢復(fù)期結(jié)束時(shí)各進(jìn)行一次各項(xiàng)指標(biāo)的全面檢測(cè).必要時(shí)，在試驗(yàn)中間檢測(cè)指標(biāo)一次。試驗(yàn)周期在三個(gè)月以上的，可在試驗(yàn)中期活殺少 量動(dòng)物（高劑量組和對(duì)照組）全面

10、檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。對(duì)瀕死或死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)檢查。二、犬的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)?zāi)康?觀察連續(xù)重復(fù)給予受試物對(duì)犬所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，首先出現(xiàn)的癥狀和嚴(yán)重程度，提供毒副反應(yīng)的靶器官及其恢復(fù)和發(fā)展情況，確定無毒反應(yīng)劑量，為擬定人用安全劑量提供爹苦。3 .皮膚用藥毒性試驗(yàn)?zāi)康?觀察動(dòng)物完整皮膚及破損皮膚短時(shí)期接觸受試物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。4 .粘膜用藥的毒性試驗(yàn)?zāi)康?觀察動(dòng)物跟睛接觸受試物后所產(chǎn)生的刺激反應(yīng)情況和恢復(fù)情況。5 .特殊毒性試驗(yàn)根據(jù)新藥審批辦法及有關(guān)中藥部分的修訂和補(bǔ)充規(guī)定冷各類型中藥新藥在特殊毒 性實(shí)驗(yàn)方面應(yīng)做項(xiàng)目如下：1 .一類新藥必須進(jìn)行特殊毒理研究。2 .保胎藥與影響胎兒子代發(fā)育的藥物，除按一般毒理學(xué)

11、要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)外，還應(yīng)增做 生殖毒性試驗(yàn)。3 .其它類新藥如在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有影響生殖或致癌的可疑性時(shí)，應(yīng)補(bǔ)做相應(yīng)的特殊毒性試驗(yàn)。一、致突變?cè)囼?yàn)中藥一類新藥，除按藥理、毒理學(xué)要求進(jìn)行試驗(yàn)外，還需做基因突變?cè)囼?yàn)，染色體畸 變?cè)囼?yàn)及動(dòng)物微核試驗(yàn)。由于中藥制劑有其特殊性，如含有生藥粉的制劑，不溶物較多；或因成分復(fù)雜，溶解度較差，以及pH等間題的研究，難以進(jìn)行體外試驗(yàn)者， 可只做體內(nèi)試驗(yàn)。(一)基因突變實(shí)驗(yàn)基因突變?cè)囼?yàn)的目的是反映受試物在基因水平上的致突變作用。主要方法有三種：其中微生物回復(fù)突變?cè)囼?yàn)適合于化學(xué)純度高的藥物，較為常用；中藥粗制品不宜做微生物回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞突變?cè)囼?yàn)適用于受試物本身

12、具有抗微生物作用的藥品；果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)是整體動(dòng)物的基因突變?cè)囼?yàn)，準(zhǔn)確性較高，在上述二法有某些陽性或可疑陽性時(shí)較為適用。果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)1 .果蠅：Oregon - R雄蠅等和 Muller 5雌蠅。2 .給藥途徑：口服或其他接近臨床用藥的途徑。3 .劑量：至少二個(gè)劑量。最高劑量為最大耐受劑量或產(chǎn)生某些毒性指征的劑量，通常以1/2LD50為基準(zhǔn)，低劑量為 1 /4LD50,無毒物最大給藥量可用最大耐受量。對(duì)照馭用溶劑及陽 性對(duì)照。4試3i ：(1)毒性試驗(yàn)：求出半數(shù)致死量。(2)繁殖力試驗(yàn)觀察受孕與不育情況。如有不育，可調(diào)低劑量。(3)樣本的大?。菏茉嚾旧w總數(shù)實(shí)驗(yàn)和陰性對(duì)照組6000

13、以上，陽性對(duì)照組 300以上，觀察給藥的雄果蠅和處女蠅交配，每 2 3天更新處女蠅，記錄雌性子代的致死作用。5 .報(bào)告 將數(shù)據(jù)列成表，包括受試染色體數(shù)， 給藥的和無生育力的雄性數(shù)，F(xiàn)2代培養(yǎng)群的數(shù)目，每一生殖細(xì)胞期檢測(cè)的帶有致死基因的染色體數(shù)。6 .判定：(1)一支培養(yǎng)管中，F(xiàn)：代合計(jì)有2(i只以上雌、雄蠅而末發(fā)現(xiàn)有野生型紅眼雄蠅者 為陽性：反之，有2只以上雄蠅者為陰性。(2)在一支培養(yǎng)管中，F(xiàn):代雌、雄蠅合計(jì)少于 汨只，或只有一只紅眼雄蠅者為可 疑，需觀察F3代。(3)僅存雌、雄蠅親本而無仔蠅者為不育。7,統(tǒng)計(jì)處理及評(píng)價(jià)：致死突變率% =致死管數(shù)/受試染色體數(shù)X 100%(1)致死突變率大于

14、自發(fā)突變率的2倍并有劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)記為陽性。(2)或?qū)⒔o藥組與對(duì)照組的致死突變率進(jìn)行比較，如對(duì)照組與給藥組的突變總數(shù)小 于1,按astenbaum -Bowman方法統(tǒng)計(jì)，總數(shù)大于 iaa按z統(tǒng)計(jì)。(二)染色體畸變?cè)囼?yàn)染色體畸變?cè)囼?yàn)的目的是反映受試物在染色體水平上的致突變作用，其中培養(yǎng)細(xì)胞 染色體畸變?cè)囼?yàn)是體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)受試物的純度及理化性質(zhì)要求較高，而精原細(xì)胞染色體 畸變?cè)囼?yàn)及嚙齒動(dòng)物顯性致死實(shí)驗(yàn)均為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，前者需用小鼠數(shù)較少，實(shí)驗(yàn)周性較短， 后者雖然工作量較大，但同時(shí)可獲得受孕率，死胎數(shù)，含死胎孕鼠百分率等較多信息.嚙齒類動(dòng)物顯性致死試驗(yàn) ：1甲動(dòng)物；性成熟小鼠。每組至少 15只雄鼠，孕鼠

15、20只以上。2 .劑量:一般采用3個(gè)劑量。受試物的最高劑量應(yīng)導(dǎo)致毒性癥狀或減少繁殖力，低毒物最大劑量可用最大耐受量對(duì)照用溶劑及陽性對(duì)照。3 .給藥途徑與方法盡可能和臨床擬用途徑相同。一般采用一天一次，連續(xù)五天給藥或其 它適宜的給藥方式。4 .交配方法：3 .骨髓采樣時(shí)間：通過預(yù)試，在12-72h不同時(shí)間內(nèi)，取5個(gè)作用點(diǎn)，找出合適采樣時(shí)間, 如無差別一般采用 24h采樣。4 .劑量及劑量級(jí)：至少采用3個(gè)劑量，最高劑量以 1/2LD50或最大耐受量為基準(zhǔn)，否則應(yīng) 說明選定劑量的理由。對(duì)照組 ：用溶媒及陽性對(duì)照。5 .標(biāo)本制作：取骨髓、涂片、Giernsa或叮吮橙熒光染色鏡檢：每只動(dòng)物至少計(jì)數(shù)100個(gè)多 染紅細(xì)胞，Giemsa染色，觀察其微核出現(xiàn)的頻度及多染紅細(xì)胞和正常紅細(xì)胞的比率?？谘具?橙熒光染色，則直接觀察微核出現(xiàn)的頻度。6