腫瘤科研項(xiàng)目方案設(shè)計(jì)

1、XX腫瘤相關(guān)功能基因 XXX研究課題設(shè)計(jì)、XX月中瘤相關(guān)基因功能研究整體技術(shù)路線Part.IXXX shRNA lentivirusPart.2Part.3Part.4預(yù)實(shí)驗(yàn)XXXnon-silencing lentivirus細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)不同腫瘤細(xì)胞株表達(dá)檢測(cè)XXXXXXrescuelentivirusXXX 基因月中Western blot & real-timePCRPart.52株高表達(dá)瘤細(xì)胞平行實(shí)驗(yàn)增殖(MTT)流式（細(xì)胞周期與凋亡）PI&Annexin V 雙染rea-time PCR克隆形成侵襲轉(zhuǎn)移（transwell實(shí)驗(yàn)）Rescue實(shí)驗(yàn)作用機(jī)理研究Genech

2、ip co-IP GST-pull down檢測(cè)下游分子表達(dá)變化分析生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的相關(guān)性XXXWestern blot 驗(yàn)證裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤臨床標(biāo)本檢測(cè)腫瘤細(xì)胞沉默后成瘤XXX相關(guān)表型分析腫瘤細(xì)胞成瘤后定點(diǎn)注射瘤體組織芯片或免疫組化XXX表達(dá)與腫瘤發(fā)與化療、放療敏感性關(guān)系的分析與實(shí)驗(yàn)研究相關(guān)分子檢測(cè)CellTissue二、合作項(xiàng)目簡(jiǎn)介整個(gè)文章的研究思路是，在臨床病理當(dāng)中發(fā)現(xiàn)在XX腫瘤標(biāo)本中XXX基因特異性高表達(dá)，在相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞系也得到一致的結(jié)果，隨后選取2株典型的細(xì)胞系用 XXX基因的RNAi的lentivirus獲得細(xì)胞、整體水平研究數(shù)據(jù)，了解該基因沉默后對(duì)腫瘤增殖，凋亡，侵襲轉(zhuǎn)移能力的

3、影響。最后檢測(cè)XXX基因的下游作用分子，尋找其可能的作用途徑。預(yù)期文章數(shù)據(jù)框架：Fig.1腫瘤病理標(biāo)本中研究的靶基因呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)（免疫組化或qPCR）Fig.2不同的XX腫瘤細(xì)胞株中該基因的表達(dá)也顯著增高Fig.3慢病毒（lentivirus ）結(jié)構(gòu)圖，腫瘤細(xì)胞感染圖片F(xiàn)ig.4靶基因RNAi慢病毒感染腫瘤細(xì)胞后，mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（qPCR和western）Fig.5在兩株細(xì)胞上沉默靶基因之后平行的MTT結(jié)果及統(tǒng)計(jì)Fig.6在兩株細(xì)胞上沉默靶基因之后流式分析細(xì)胞周期，計(jì)算凋亡率Fig.7在兩株細(xì)胞上沉默靶基因之后克隆形成能力變化，圖片和統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.8用腫瘤細(xì)胞感染 RNAi慢病毒

4、制備成穩(wěn)定細(xì)胞株，然后做裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，裸鼠圖片，每天量瘤子大小，做腫瘤生長(zhǎng)曲線，4周處死稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。Fig.9下游基因的qPCR檢測(cè)結(jié)果（如果有陽(yáng)性結(jié)果就放上去）Fig.10 western blot驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果三、實(shí)驗(yàn)方案1、XXX在XX細(xì)胞表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：選取多株 XX細(xì)胞株，檢測(cè) XXX基因的表達(dá)，高表達(dá) XXX基因的兩株細(xì)胞用于后 續(xù)RNAi的研究。1 . qPCR檢測(cè)不同細(xì)胞株中 XXX的mRNA水平；2 .對(duì)XXX表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞株進(jìn)行感染預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定各個(gè)細(xì)胞株病毒感染的難易程度3 .將有XXX表達(dá)并且容易感染的腫瘤細(xì)胞感染RNAi病毒并進(jìn)行 MTT實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_

5、定各細(xì)胞XXX的表達(dá)以及在 MTT實(shí)驗(yàn)中哪株細(xì)胞的功能最明顯，作為選擇相應(yīng)細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)研究的依據(jù)。實(shí)驗(yàn)在多株腫瘤細(xì)胞上平行進(jìn)行（如qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞低表達(dá)XXX ,則該細(xì)胞不進(jìn)入 MTT實(shí)驗(yàn)）NC Con RNAi分組項(xiàng)目（驗(yàn)證）qPCR-XXX 法）細(xì)胞增殖檢測(cè)（MTT、2XXX在腫瘤細(xì)胞系中的功能研究實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇12株細(xì)胞系進(jìn)行 XXX的相應(yīng)功能的實(shí)驗(yàn)研究，獲得一套in vitro實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。同時(shí)在 XXX RNAi獲得功能表型的變化后，重新導(dǎo)入一個(gè)突變的XXX表達(dá)病毒載體，使得功能變化得到回復(fù)，從而驗(yàn)證RNAi反應(yīng)和基因功能的特異性實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_定 XXX基因

6、在腫瘤細(xì)胞中的功能Knock Down XXX 功能驗(yàn)證XXX siRNA 病毒ControlNCXXX RNAi組別說(shuō)明空白對(duì)照RNAi陰性對(duì)昭八、RNAi病毒qPCR-XXXWestern-XXXMTT法）細(xì)胞增殖檢測(cè)（annexin-v/pi雙染法）凋亡檢測(cè)（克隆形成（克隆形成實(shí)驗(yàn)）3、XXX作用機(jī)理研究（下游相關(guān)基因檢測(cè)）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：根據(jù)上述的實(shí)3結(jié)果確定 XXX的功能后，對(duì)其相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè) （qPCR或WB法）， 確定XXX作用的信號(hào)傳導(dǎo)通路。相關(guān)基因可以是以前研究報(bào)道的，也可以是經(jīng)典的途徑如與凋 亡相關(guān)的、增殖相關(guān)的或侵襲相關(guān)的途徑實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_定 XXX的作用機(jī)制4、XXX在動(dòng)物水

7、平功能研究實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：運(yùn)用慢病毒感染后的腫瘤細(xì)胞直接與對(duì)照細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤，4周后比較瘤體大小，計(jì)算抑瘤率，也可以采用細(xì)胞成瘤后定點(diǎn)注射瘤體的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，兩種方式互為驗(yàn)證，獲得一套高質(zhì)量的in vivo實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模涸谡w水平驗(yàn)證XXX基因在腫瘤成瘤過(guò)程中的功能分組ControlNC-1RNAi -1NC-2RNAi -2組別說(shuō)空白對(duì)用陰性對(duì)照病毒用RNAi病毒定點(diǎn)注射陰定點(diǎn)注射明昭 八、感染細(xì)胞成瘤感染細(xì)胞成瘤性對(duì)照病毒病毒RNAi5、XXX表達(dá)與臨床樣本的關(guān)系（可用組織芯片技術(shù)）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：收集腫瘤組織樣本， 獲得相應(yīng)的蛋白和 RNA ,進(jìn)行XXX表達(dá)Pattern和表達(dá)量分析， 臨床

8、標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模河^察 XXX表達(dá)情況和腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、藥物敏感性、預(yù)后的關(guān)系四、候選基因信息：AXXX; CXXX; EXXX; iXXX; NXXX （僅以以上幾個(gè)基因?yàn)槔?，我們基因?kù)中已有有效 RNAi慢病毒顆粒）（考慮到科研工作的需要，把具體的基因信息隱去了，還請(qǐng)諒解！）AXXX 2002年才被克隆，屬于比較新的基因，它是大腸桿菌 AXXb的同源物，涉及其研究的文章可以檢索到的總共大約有10 篇左右，目前主要是停留在研究其作為雙脫氧酶可以通過(guò)氧化去甲基化催化去除DNA的1-methyladenine和3-methylcytosine ,從而起到DNA修復(fù)的作用。該蛋白主

9、要是與雙鏈 DNA結(jié)合,2008年的nature剛剛報(bào)道了這種結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)。月中瘤方面只見(jiàn)到其在腦月中瘤中有高表達(dá)的報(bào)道。該基因的研究前景廣闊，可以從以下幾個(gè)方面：1該基因產(chǎn)物在腫瘤中的作用，包括腫瘤的生存、凋亡、對(duì)細(xì)胞周期的影響、對(duì)腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移方面的作用。還可研究其是否可以作為腫瘤標(biāo)記物來(lái)輔助臨床診斷和治療。可選擇得腫瘤類型可以涵蓋各種各樣的腫瘤，因?yàn)闆](méi)有同類報(bào)道，所有在腫瘤領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)都將是在世界上第一次。非常適合開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。如果有結(jié)果出來(lái)基本上可以確定該課題組在國(guó)際上的領(lǐng)先地位，應(yīng)該特別容易發(fā)文章，申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)。4 .由于報(bào)道了其與DNA結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，因此，可以針對(duì)這種結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)其特）領(lǐng)域

10、，均有2 異的抑制劑，所合成的抑制劑無(wú)論在基礎(chǔ)科研還是臨床治療（見(jiàn)廣闊的應(yīng)用前景。有巨大的商業(yè)前景。CXXX 2003 年 12月才被識(shí)別，屬于比較新的基因，涉及其研究的文章可以檢索到的總共大約有10 篇左右，目前主要是停留在組學(xué)分析上，對(duì)基因的功能知之甚少，只見(jiàn)到2篇其在Crohn's disease和ulcerative colitis中有相關(guān)性的報(bào)道。腫瘤方面未見(jiàn)任何報(bào)道。該基因的研究前景廣闊，可以從以下幾個(gè)方面研究：1該基因在正常和腫瘤組織的表達(dá)譜如何。適合開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。2該基因產(chǎn)物在腫瘤中的作用，包括腫瘤的生存、凋亡、對(duì)細(xì)胞周期的影響、對(duì)腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移方面的作用。還可研究其是否可

11、以作為腫瘤標(biāo)記物來(lái)輔助臨床診斷和治療?？蛇x擇的腫瘤類型可以涵蓋各種各樣的腫瘤，如果有結(jié)果出來(lái)基本上可以確定該課題組在國(guó)際上的領(lǐng)先地位，應(yīng)該特別容易發(fā)文章，申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)。5 .根據(jù)生物信息學(xué)分析其屬于 cyclin超家族的成員，有Cyclin box fold,有Protein binding domain ，該結(jié)構(gòu)參與cell-cycle 和 transcription 調(diào)控。該結(jié)構(gòu)存在于cyclins, TFIIB和 Retinoblastoma (RB). cyclins 由 8 類 cell cycle調(diào)節(jié)因子組成，可以起調(diào)節(jié)cyclin dependent kinases (CDKs) 的

12、 作用 . TFIIB 是一個(gè)可以結(jié)合TATA box的轉(zhuǎn)錄因子.Cyclins, TFIIB和RB各帶有兩個(gè)拷貝的該結(jié)構(gòu)域。基于 這些可以參考上述幾個(gè)分子的功能設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，看是否CXXX也有這些相似的功能。 iXXX 是抑癌基因家族中的一個(gè)較新的癌基因，直接抑制p53 活性，由于p53 的廣泛作用，ixxxx必然在多種月中瘤中發(fā)揮其促癌作用，可以想見(jiàn)其作用的月中瘤類 的相互作用，應(yīng)是重p53 型應(yīng)當(dāng)較多，但是目前研究報(bào)道尚少。機(jī)制方面，與要的研究方向。可以從以下幾個(gè)方面開(kāi)展工作：1、該基因在正常和腫瘤的表達(dá)譜預(yù)實(shí)驗(yàn)2、該基因功能作用實(shí)驗(yàn)3、與P53 蛋白作用關(guān)系及調(diào)控機(jī)制研究NXXX 1998 年被基因定位，屬于研究結(jié)果比較少的基因