單克隆抗體制備過程中經(jīng)過兩次篩選.

1、單克隆抗體制備過程中經(jīng)過兩次篩選 單克隆抗體制備過程中，總共有兩次篩選，第一次篩選出雜交瘤細(xì)胞，第二次篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì) 胞，兩次篩選的原理和方法是不相同的。第一次篩選的原理與方法：細(xì)胞融合后，雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)是第一次篩選的關(guān)鍵。普遍采用的HAT 選擇性培養(yǎng)液是在普通的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依據(jù)是細(xì)胞中的 DNA 合成有兩條途徑：一條途徑是生物合成途徑（“D途徑”，即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，為DNA 分子的合成提供原料。在此合成過程中，葉酸作為重要的輔酶參與這一過程，而HAT 培養(yǎng)液中氨基喋呤是一種葉酸的拮

2、抗物，可以阻斷DNA 合成的“D途徑”另一條途徑是應(yīng)急途徑或補(bǔ)救途徑（“S途徑”），它是利用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶（HGPRT 和胸腺嘧啶核苷激酶（TK 催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應(yīng)的核苷酸，兩 種酶缺一不可。因此，在HAT 培養(yǎng)液中，未融合的效應(yīng) B 細(xì)胞和兩個(gè)效應(yīng) B 細(xì)胞融合的“D途徑”被氨基喋呤阻斷，雖“S途徑”正常，但因缺乏在體外培養(yǎng)液中增殖的能力，一般 10d 左右會(huì)死亡。對于骨髓瘤細(xì)胞以及自身融合細(xì)胞而言，由于通常采用的骨髓瘤細(xì)胞是次黃嘌呤一鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HGPRT 細(xì)胞，因此自身沒有“S途徑”且“D途徑”又被氨基喋呤阻斷，所以在 HAT 培養(yǎng)液中也不能

3、增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤細(xì)胞與效應(yīng)B 細(xì)胞相互融合形成的雜交瘤細(xì)胞， 既具有效應(yīng) B 細(xì)胞的“途徑”又具有骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)液中長期增殖的特性，因此能在HAT 培養(yǎng)液中選擇性存活下來，并不斷增殖。第二次篩選的原理和方法： 在實(shí)際免疫過程中， 由于采用連續(xù)注射抗原的方法， 且一種抗原決定簇刺激機(jī)體 形成相對應(yīng)的一種效應(yīng) B 淋巴細(xì)胞，因此，從小鼠脾臟中取出的效應(yīng)B 淋巴細(xì)胞的特異性是不同的，經(jīng)HAT 培養(yǎng)液篩選的雜交瘤細(xì)胞特異性也存在差異，所以必須從雜交瘤細(xì)胞群中篩選出能產(chǎn)生針對某一預(yù)定抗原快定簇的特異性 雜交瘤細(xì)胞。通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種在多孔的細(xì)胞培養(yǎng)

4、板上，使每一孔 含一個(gè)或幾個(gè)雜交瘤細(xì)胞（理論上30%的孔中細(xì)胞數(shù)為 0 時(shí)，才能保證有些孔中是單個(gè)細(xì)胞） ，再由這些單細(xì)胞克隆生長，最終選出分泌預(yù)定特異抗體的雜交細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。因此，單克隆抗體制備過程中，兩次篩選的原理和 方法是不相同的。單克隆抗體制備的基本原理與過程原理：B 淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力。B 細(xì)胞的這種能力和量是有限的，不可能持續(xù)分化增殖下去，因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B 細(xì)胞與非分泌型的骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，再進(jìn)一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞是既具有瘤的無限生長的能力，又具有 產(chǎn)生特異性

5、抗體的 B 淋巴細(xì)胞的能力， 將這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價(jià)、 單一的特異性抗體。這種技術(shù)即稱為單克隆抗體技術(shù)。過程1 ）免疫脾細(xì)胞的制備 制備單克隆抗體的動(dòng)物多采用純系 Balb/c 小鼠。免疫的方法取決于所用抗原的性質(zhì)。免疫方 法同一般血清的制備，也可采用脾內(nèi)直接免疫法。2） 骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與篩選在融合前，骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)經(jīng)過含 8-AG 的培養(yǎng)基篩選，防止細(xì)胞發(fā)生突變恢復(fù) HGPRT 的活性（恢復(fù) HGPRT 的活性的細(xì)胞不能在含 8-AG 的培養(yǎng)基中存活） 。 骨髓瘤細(xì)胞用 10%小牛血清的培養(yǎng)液在細(xì)胞培 養(yǎng)瓶中培養(yǎng)， 融合前 24h換液一次，使骨髓瘤

6、細(xì)胞處于對數(shù)生長期。3）細(xì)胞融合的關(guān)鍵 :1 技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗。例如，供者淋巴細(xì)胞沒有查到免疫應(yīng)答。這必然要失敗的。2 融合試驗(yàn)最大的失敗原因是污染，融合成功的關(guān)鍵是提供一個(gè)干凈的環(huán)境，以及適宜的無菌操作技術(shù)。4）陽性克隆的篩選 應(yīng)盡早進(jìn)行。 通常在融合后 10 天作第一次檢測， 過早容易出現(xiàn)假陽性。 檢測方法應(yīng)靈敏、 準(zhǔn)確、而且簡便快速。具體應(yīng)用的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)，以及所需單克隆抗體的功能進(jìn)行選擇。常用的方法有RIA 法、ELISA 法和免疫熒光法等。其中 ELISA 法最簡便，RIA 法最準(zhǔn)確。陽性克隆的篩選應(yīng)進(jìn)行多次，均陽性時(shí)才確定為陽 性克隆進(jìn)行擴(kuò)增。5）克隆化 克隆

7、化的目的是為了獲得單一細(xì)胞系的群體?？寺』瘧?yīng)盡早進(jìn)行并反復(fù)篩選。這是因?yàn)槌跗诘碾s交瘤細(xì) 胞是不穩(wěn)定的，有丟失染色體的傾向。反復(fù)克隆化后可獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株?？寺』姆椒ê芏啵畛Ｓ玫?是有限稀釋法。（ 1 ）顯微操作法：在顯微鏡下取單細(xì)胞，然后進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)。這種方法操作復(fù)雜，效率低，故不常用。（ 2）有限稀釋法：將對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)液作一定的稀釋后，按每孔1 個(gè)細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，細(xì)胞增值后成為單克隆細(xì)胞系。第一次克隆化時(shí)加一定量的飼養(yǎng)細(xì)胞。由于第一次克隆化生長的細(xì)胞不能保證單克隆化，所以為獲得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株需經(jīng)23 次的再克隆才成。 應(yīng)該注意的是，每次克隆化過程中所有有

8、意義的細(xì)胞都 應(yīng)冷凍保存，以便重復(fù)檢查，避免丟失有意義的細(xì)胞。（3）軟瓊脂法：將雜交瘤細(xì)胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。在瓊脂中的細(xì)胞不能自由移動(dòng)，彼此互不相混， 從而達(dá)到單細(xì)胞培養(yǎng)的目的。但此法不如有限稀釋法好。（4）熒光激光細(xì)胞分類法：用抗原包被的熒光乳膠微球標(biāo)記雜交瘤細(xì)胞，然后根據(jù)抗原與雜交瘤細(xì)胞結(jié)合的特異性 選出細(xì)胞，并進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)。6）細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇7 ）大規(guī)模單克隆抗體的制備選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早進(jìn)行抗體制備，因?yàn)槿诤霞?xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長，發(fā)生污染、染包體丟失和細(xì)胞死亡的機(jī)率增加?？贵w制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng) 液中分離單克隆抗體。該法需用

9、特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。最普 遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用 BALB/c 小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集510ml 的腹水，有時(shí)甚至超過 40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達(dá)數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少， 便于抗體的純化。摘要在單克隆抗體制備中兩次提到篩選問題，對于兩次篩選的方法和目的始終是一些人的困惑，那么兩次篩選 的目的和方法到底是什么。單克隆抗體制備過程中兩次提到了篩選，對于兩次篩選中的目的和方法許多

10、人也存在疑惑，那么到底是如何篩選的 呢現(xiàn)總結(jié)如下：第一次篩選：首先在（效應(yīng)）B 淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行雜交時(shí)可能出現(xiàn)的情況應(yīng)該先弄清楚，（一）可能的情況有：1（效應(yīng)）B 淋巴細(xì)胞和（效應(yīng)） B 淋巴細(xì)胞的融合2（效應(yīng)）B 淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合（即雜交瘤細(xì)胞）3骨髓瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合（即瘤瘤細(xì)胞）4單個(gè)骨髓瘤細(xì)胞5單個(gè)（效應(yīng)） B 淋巴細(xì)胞（二）篩選的目的 獲得雜交瘤細(xì)胞（三）篩選的方法用選擇性培養(yǎng)基來完成，即HAT 培養(yǎng)基。含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶，其中氨基喋呤可阻斷DNA 合成的主要途徑。主要途徑阻斷后，依靠應(yīng)急途徑即在HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）和TK

11、（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黃嘌呤合成DNA,缺少其中一種，DNA 合成不能發(fā)生。用于雜交的骨髓瘤細(xì)胞系均由經(jīng)有毒藥物誘導(dǎo)而成選擇產(chǎn)生的代謝缺陷型細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)均無 TK 或 HGPRT 所以單個(gè)或融合骨髓瘤細(xì)胞在 HAT 培養(yǎng)液中將死亡。B 細(xì)胞雖然有 HGPRT 和 TK,但在體外通常培養(yǎng)條件下，尤其是在單個(gè)細(xì)胞環(huán)境下難于長期存活和增殖傳代。 因此只有雜交瘤細(xì)胞才能在 HAT 培養(yǎng)液中生長繁殖。 所以通過以上方法可以選擇出雜交瘤細(xì)胞，但雖然都是雜交瘤細(xì)胞，但可能是同一抗原的不同抗原決定基刺激產(chǎn)生 的。所以產(chǎn)生抗體是不純的。如果不進(jìn)一步提純，這樣得到的是多克隆抗體。所以就有了第二次篩選。第二次篩選 要想獲得單克隆抗體，所以必須得到由一個(gè)細(xì)胞分裂而成的一個(gè)細(xì)胞群，由這樣的細(xì)胞群產(chǎn)生的抗體才是真正意義的單克隆抗體。（一 ） 篩選的目的 篩選只針對某一種特定的抗原決定簇產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，即得到由一個(gè)細(xì)胞分裂而成的一個(gè)細(xì)胞群并且能產(chǎn)生 所需抗體（二）篩選的方法1、分離單個(gè)細(xì)胞置入多孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中培養(yǎng)2、檢測每孔細(xì)胞是否產(chǎn)生所注射抗原的抗體（即教材插圖中提到的選出能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群）所以篩選的條件 是兩層