胡蘿卜愈傷組織的誘導與繼代培養(yǎng)實驗報告

1、 本科學生綜合性實驗報告學號 姓名 學院 生命科學學院 專業(yè)、班級 實驗小組及成員 實驗課程名稱 植物組織培養(yǎng)實驗 教師及職稱 龍維彪（講師） 開課學期 2011 至 2012 學年 下 學期 填報時間 2012 年 6 月 1 日云南師范大學教務處編印實驗序號二實驗名稱胡蘿卜愈傷組織的誘導和增殖培養(yǎng)實驗時間2012.04.052012.05.24實驗室實驗室325實驗內容：1胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)基的配制2 胡蘿卜愈傷組織的誘導3 胡蘿卜愈傷組織繼代培養(yǎng)基的配制4 胡蘿卜愈傷組織的繼代培養(yǎng)1實驗目的1) 通過本次實驗，進一步熟悉配制培養(yǎng)基的流程及操作中應注意的事項，學會設計和篩選胡蘿卜愈傷組

2、織誘導培養(yǎng)基配方。2) 通過本次實驗，能夠熟練掌握外植體的表面消毒技術和無菌操作技術。3) 通過本次實驗，能夠熟練掌握愈傷組織繼代培養(yǎng)的基本操作技術，進一步熟悉、規(guī)范無菌操作技術。2 實驗原理、實驗流程或裝置示意圖實驗原理1) 將事先配制好的培養(yǎng)基母液按一定比例稀釋至濃度為培養(yǎng)基中規(guī)定的使用濃度，再加入瓊脂、蔗糖、生長調節(jié)物質等，制備成符合要求的培養(yǎng)基。2) 將胡蘿卜的貯藏根（根的變態(tài)）表面消毒后切割成小塊接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，誘導外植體脫分化產生愈傷組織。3) 對愈傷組織進行繼代培養(yǎng)可以得到更多的愈傷組織。實驗流程配置胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)基 接種胡蘿卜肉質根誘導愈傷組織產生配置胡蘿卜

3、愈傷組織增殖培養(yǎng)基 接種胡蘿卜愈傷組織進行增殖 實驗結果觀察記錄3實驗設備及材料1）實驗用具和儀器冰箱、普通天平、三角瓶、果醬瓶、移液管、量筒、燒杯、容量瓶、玻璃棒、醫(yī)用口杯、精密pH試紙（pH5.47.0）、藥勺、稱量紙、標簽紙、封口膜、橡皮筋、棉線、電爐、高壓蒸汽滅菌鍋、電磁爐等。酒精棉球、小塊紗布、已滅菌濾紙、槍狀鑷子、手術剪、解剖刀、已滅菌培養(yǎng)皿、酒精燈、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、100ml三角瓶、500或1000ml搪瓷杯、50ml量筒、1ml、2ml、5ml、10ml吸管等。2）藥品和試劑：MS培養(yǎng)基母液、常用試劑母液、瓊脂、蔗糖、生長調節(jié)物質、蒸餾水、1mol·L-1HC

4、l、1mol·L-1NaOH、胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)基、無菌水、75酒精、0.1%HgCl2，、愈傷組織繼代培養(yǎng)基、蒸餾水等。3)材料：胡蘿卜肉質直根、處于脫分化進程中的胡蘿卜愈傷組織一實驗設計方案4實驗方法步驟及注意事項實驗步驟：(1)胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)基的配方及配制體積A、培養(yǎng)基配方設計：a根據(jù)培養(yǎng)的目的選擇一種培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。b確定培養(yǎng)基中各種激素的濃度及相對比例B配方：MS基本培養(yǎng)基 1mg/L 2,4-D0.5mg/L 6-BA0.7瓊脂3蔗糖C配制體積：每小組配制0.5L，每人用50ml三角瓶分裝5瓶，每瓶約裝25ml培養(yǎng)基。(2)胡蘿卜愈傷組織誘導培養(yǎng)基的配制步

5、驟A. 藥品及用具的準備B. 培養(yǎng)基配制a.根據(jù)需要配制的培養(yǎng)基的量稱好所需的瓊脂（3.5g），放入醫(yī)用口杯中，加入適量的蒸餾水（估計加入母液后不超過配制總量）置于電磁爐上加熱溶解，邊加熱邊用玻棒攪動。b.MS基本培養(yǎng)基配置：（配置前先檢查各母液情況，如發(fā)現(xiàn)有霉菌和沉淀結晶產生，就不能再使用）。大量元素母液：25ml；微量元素母液：2.5ml；鐵鹽母液：2.5ml；有機物母液：各2.5ml。0.5mg/L 2,4-D取1ml， 0.5mg/L 6-BA取2.5ml?；靹?。c.待瓊脂完全溶解后，加入規(guī)定用量的蔗糖（15g），繼續(xù)加溫并不斷攪拌，待瓊脂煮透后端離火源，再加入所需用量的母液（可事先取

6、好放于一燒杯中），最后加蒸餾水至所需體積，即500ml。C.調節(jié)培養(yǎng)基的酸堿性至pH5.8培養(yǎng)基配制好后應立即進行pH值的調整。用精密pH試紙測試。培養(yǎng)基若偏酸時用lmol·L-1 NaOH來調節(jié)，偏堿則可用lmol·L-1 HCl來調節(jié)。D.培養(yǎng)基的分裝配制好的培養(yǎng)基要趁熱分裝，培養(yǎng)基分裝完后，用封口膜封嚴瓶口，并用棉線扎緊。本次實驗中500ml分裝到20個三角瓶，每人5瓶。E.培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基分裝后應立即置于高壓蒸氣滅菌鍋內進行滅菌。消毒滅菌時，壓力表讀數(shù)約為1.06kgf·cm-2或0.105 MPa （可在0.105 0.12MPa間，但不得超過0.14

7、 MPa），溫度121時保持1530 min左右即可。F.無菌蒸餾水和接種工具準備用果醬瓶裝自來水，用不透氣的封口膜封口滅菌后即為無菌水。接種工具也是用紙包好滅菌。（3）接種前準備工作A外植體表面滅菌前的準備工作10mina 接種室的清潔和消毒以及超凈工作臺的開機和消毒：超凈工作臺消毒（75%酒精）, 紫外燈+風機 關紫外燈，并保持風機吹風狀態(tài)；將各組的培養(yǎng)基，無菌水、解剖刀、鑷子等操作工具放到超凈臺上，并進行消毒待用。b消毒溶液、無菌水、裝材料的容器、解剖刀、鑷子、培養(yǎng)皿、計時器、待用培養(yǎng)基等的準備。c配置消毒溶液：1g HgCl2 +1000ml蒸餾水，配置成0.1%的HgCl2。（100

8、0毫升的2份）B 實驗材料的準備a 準備新鮮健康的胡蘿卜肉質直根作實驗材料；b 實驗材料的修整、刷洗、沖洗； c 用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自來水沖凈。每組12根胡蘿卜，用試管刷和肥皂洗凈，進行初次表面清潔；洗凈后用干凈的燒杯盛放，用小刀切成合適大小的4段（每人1段），轉入超凈臺待用。（4）植物材料的表面滅菌和接種A. 操作人員洗手消毒B. 裝材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒C. 將待消毒的材料浸入75的酒精中10秒，取出轉入無菌水沖洗干凈。（酒精單獨一個杯子裝，消毒完畢轉下一組使用）D. 將無菌水倒出，并倒入消毒劑（ 0.1 %HgCl2 ）并計時30分鐘；（同一瓶子中操作即可，但注意不要

9、碰到瓶口等關鍵部位）E. 到預定時間（30分鐘）后，倒出消毒液，并用無菌水清洗4遍，保證消毒液全部清潔干凈。F. 將洗凈的材料用滅過菌的鑷子夾出，放到干凈的濾紙上吸干水分，并在濾紙上操作后續(xù)步驟；G. 將已表面消毒的材料，從正中間豎直一分為2，然后切去表層，再切成扇形大小的方塊，厚度約0.51cm左右，不要太薄。H. 材料切塊后接種到誘導培養(yǎng)基上。（每瓶培養(yǎng)基放35塊材料即可，材料不要過于集中）I. 封口膜封好后，黑暗條件培養(yǎng)。（5）胡蘿卜愈傷組織增殖培養(yǎng)基的配制A配方：MS基本培養(yǎng)基 2mg/L NAA0.2mg/L 6-BA200mg/L水解酪蛋白 0.7瓊脂3蔗糖B配制流程：（胡蘿卜愈傷

10、組織誘導培養(yǎng)基的配制）a) 藥品及用具的準備b) 培養(yǎng)基配制a.根據(jù)需要配制的培養(yǎng)基的量稱好所需的瓊脂（3.5g），放入醫(yī)用口杯中，加入適量的蒸餾水（估計加入母液后不超過配制總量）置于電磁爐上加熱溶解，邊加熱邊用玻棒攪動。b.MS基本培養(yǎng)基配置：（配置前先檢查各母液情況，如發(fā)現(xiàn)有霉菌和沉淀結晶產生，就不能再使用）。大量元素母液：25ml；微量元素母液：2.5ml；鐵鹽母液：2.5ml；有機物母液：各2.5ml。0.1mg/L 6-BA取1ml，1mg/L NAA取1ml?；靹颉.待瓊脂完全溶解后，加入規(guī)定用量的蔗糖（15g），繼續(xù)加溫并不斷攪拌，待瓊脂煮透后端離火源，再加入100mg水解酪蛋

11、白和所需用量的母液（可事先取好放于一燒杯中），最后加蒸餾水至所需體積，即500ml。c) 調節(jié)培養(yǎng)基的酸堿性至pH5.8d) 培養(yǎng)基的分裝配制好的培養(yǎng)基要趁熱分裝，培養(yǎng)基分裝完后，用封口膜封嚴瓶口，并用棉線扎緊。本次實驗中500ml分裝到20個三角瓶，每人5瓶。e) 培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基分裝后應立即置于高壓蒸氣滅菌鍋內進行滅菌。消毒滅菌時，壓力表讀數(shù)約為1.06kgf·cm-2或0.105 MPa （可在0.105 0.12MPa間，但不得超過0.14 MPa），溫度121時保持1530 min左右即可。f) 接種工具準備接種工具用紙包好滅菌。（6）胡蘿卜愈傷組織的繼代培養(yǎng)A繼代培養(yǎng)前

12、準備工作a) 接種室的清潔和消毒；b) 超凈工作臺的開機和消毒；c) 剪刀、鑷子、已滅菌培養(yǎng)皿和濾紙、待用培養(yǎng)基等的準備；d) 實驗材料的準備（選擇裝有無污染的已分化出愈傷組織的外植體的三角瓶擺放于凈工作臺上）B愈傷組織繼代培養(yǎng)a) 將上次接種在愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的無污染的外植體產生的愈傷組織在已滅菌的培養(yǎng)皿中剝離b) 將剝離的愈傷組織轉接到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，封好封口膜c) 將培養(yǎng)瓶放置在25 全黑暗條件下進行愈傷組織的增值培養(yǎng)。兩周后觀察結果。注意事項（1）培養(yǎng)基配制過程注意事項1) 玻璃器皿的洗滌。2) 天平的使用。3) 配方中各組分的含量（2）培養(yǎng)基滅菌注意事項1) 滅菌前檢查鍋內

13、是否有足夠的水。2) 裝鍋不可過滿。3) 為了保證滅菌徹底，在蒸氣滅菌鍋增壓前應先將滅菌鍋內的冷空氣放盡。4) 培養(yǎng)基消毒滅菌時間不宜過長，也不可超過滅菌鍋規(guī)定的壓力范圍；否則，培養(yǎng)基中的蔗糖、有機物質，特別是維生素類物質就會分解，導致培養(yǎng)基變質、變色，甚至難以凝固。5) 當滅菌完成后，應切斷電源或熱源，待滅菌鍋內氣壓接近“0”時，方可打開放氣閥，擰開滅菌鍋蓋取出培養(yǎng)基。切勿為急于取出培養(yǎng)基而打開放氣閥放氣，否則鍋內氣壓下降太快會引起減壓沸騰，導致滅菌鍋內各容器中的培養(yǎng)基溢出，造成浪費或污染，甚至燙傷工作人員。3）無菌操作過程注意事項1) 操作前要洗手消毒2) 操作器械要滅菌，使用時可用酒精消

14、毒和灼燒滅菌3) 接種時和封口時在酒精燈前操作4) 封口膜一定要綁好5實驗數(shù)據(jù)處理方法：采用記錄原數(shù)據(jù)以及課本資料提供數(shù)據(jù)進行配制及使用。6參考文獻：（1）植物組織培養(yǎng)教程 李俊明 朱登元 中國農業(yè)大學出版社 2005.9（2）植物組織和細胞培養(yǎng) 中國科學院上海植物生理研究所細胞室 上?？茖W技術出版社 1978（3）植物細胞工程實驗技術 孫靜三 桂耀林 北京 科學出版社 1995二實驗報告1 實驗現(xiàn)象與結果A實驗結果記錄表：愈傷組織誘導結果：總接種瓶數(shù)5瓶總接種塊數(shù)15塊污染瓶數(shù)4瓶污染塊數(shù)11塊未污染瓶數(shù)1瓶未污染塊數(shù)4塊未污染塊中愈傷組織發(fā)生塊數(shù)3塊愈傷組織發(fā)生率75%愈傷組織發(fā)生情況記錄

15、愈傷組織的色澤較新鮮，但比較少污染情況及原因分析污染瓶中，有1 瓶是霉菌污染，3瓶細菌污染?？赡苁墙臃N過程中接種器械消毒不夠，掀開封口膜時碰到了封口膜里面，也可能是封口膜沒綁好。愈傷組織繼代培養(yǎng)結果：繼代培養(yǎng)沒有受到污染，愈傷組織增殖情況較好，呈現(xiàn)不規(guī)則狀。顏色淺黃，注意看會有一些小黑點，愈傷組織開始老化，部分開始分化。B實驗結果圖片2 對實驗現(xiàn)象、實驗結果的分析及其結論1) 胡蘿卜愈傷組織誘導實驗中，被污染了4瓶，說明在整個實驗過程中，一定要注意無菌操作，否則，任何一個環(huán)節(jié)染菌都會導致外植體被污染，實驗失敗。2) 外植體的選擇很重要，由于實驗中選了比較小的胡蘿卜，與其他組相比愈傷組織的量或是色澤方面都較差，也許是因為不一樣大小的胡蘿卜，但消毒時間（30min）是一樣的，可能使得胡蘿卜組織受傷較重。3) 同一小組中，或同一個人的實驗結果都會不一樣，這是由于個人操作差異，或是培養(yǎng)基分裝時沒混勻等原因造成的。4) 外植體經(jīng)過消毒等處理，可在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，誘導脫分化形成愈傷組織，愈傷組織再在繼代培養(yǎng)基上可以增殖得到更多更好的愈傷組織。3 實驗總結1) 植物組織培養(yǎng)實驗一般歷時較長，要將實驗過程中的每一部分的操作內容記錄下來，若出現(xiàn)問題方便排查問題所在。2) 由于是以小組形式進行實驗，所以每個人的工作