EPO的檢測技術(shù)研究進(jìn)展

1、EPO的檢測技術(shù)研究進(jìn)展項(xiàng)目完成人：宓捷波 王杉 常文保項(xiàng)目完成單位：北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院生化分析組 國家興奮劑及運(yùn)動營養(yǎng)測試研究中心摘 要 促紅細(xì)胞生成素（EPO）是一種臨床上廣泛應(yīng)用的重要藥物，也是近年來興奮劑檢測的熱點(diǎn)。本文主要從EPO的產(chǎn)生、應(yīng)用出發(fā)，對EPO的結(jié)構(gòu)、特性及其檢測方法進(jìn)行了介紹及評價，重點(diǎn)探討了競技體育中EPO的檢測技術(shù)，并對檢測前景作了展望。關(guān)鍵詞 促紅細(xì)胞生成素（EPO），興奮劑檢測，重組一、前言EPO全稱促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin），主要由腎臟近曲小管附近的細(xì)胞合成和分泌，它的基本生理功能是刺激骨髓紅細(xì)胞的生成和釋放。1985年，人們利用基

2、因重組技術(shù)合成生成了重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO），在臨床上主要用于治療腎性貧血以及腫瘤等各種慢性疾患所伴發(fā)的貧血。由于EPO能促進(jìn)血液中紅細(xì)胞數(shù)量的增加，從而提高血液的載氧能力，EPO也被某些耐力項(xiàng)目（如長跑、自行車、游泳、劃船等）的運(yùn)動員濫用借以提高體能，而長期使用rhEPO，對運(yùn)動員來說，它可能帶來一時的榮譽(yù)，但也可以給其自身的健康造成嚴(yán)重的危害。有報道稱，1988年在自行車比賽中3名運(yùn)動員猝死、1989年5名荷蘭運(yùn)動員喪生，可能均與使用了大劑量的rhEPO有關(guān)。為此，1989年，國際奧委會醫(yī)學(xué)委員會將EPO正式列為禁用藥物。但是由于目前尚無有效的檢測方法，因此，這一法規(guī)并不具有威脅

3、力。1998年，國際奧委會曾提出三年內(nèi)研究出檢測EPO的方法，但直到2000年，EPO濫用的烏云仍籠罩著悉尼奧運(yùn)會。因此如何對EPO進(jìn)行有效的檢測是當(dāng)前人們關(guān)注的熱點(diǎn)。本文主要就EPO的檢測技術(shù)及其在興奮劑檢測中的應(yīng)用作一概述。二、EPO的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生理特性EPO屬肽類激素，是一種單鏈的酸性糖蛋白。完整的EPO分子由多肽和糖基構(gòu)成，分子量為3200039000D（道爾頓），多肽鏈部分分子量為18398D2，由165個氨基酸殘基組國家自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號：20175002）資助項(xiàng)目成，含有2個二硫鍵（位于7-161位與29-33位）、一個碳末端的精氨酸（Arg）殘基。EPO的糖基包括三個氮末端N

4、-糖基（分別位于天冬氨酸Asp24，Asp38，Asp83）和一個絲氨酸O-糖基（位于Ser126）。它們的主要成分是甘露糖、巖藻糖、唾液酸等低聚糖。3其中，唾液酸在維持EPO分子的酸性、阻斷細(xì)胞表面半乳糖受體結(jié)合、防止EPO失活等方面有重要作用。4EPO作用于骨髓紅系造血干細(xì)胞，促使干細(xì)胞分裂、分化，生成紅細(xì)胞的過程稱為“促紅細(xì)胞生成”。由于紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核、核糖體以及線粒體等重要細(xì)胞成分，不能通過自身的分裂、分化，獲得數(shù)量上的增加。5因此，“促紅細(xì)胞生成”是機(jī)體產(chǎn)生新生紅細(xì)胞的唯一途徑。而EPO作為促使造血干細(xì)胞分化的重要成分，對于紅細(xì)胞生成有著決定性的作用。在成人體內(nèi)，EPO的絕大部分由

5、腎臟產(chǎn)生，少量來自肝臟（胎兒及新生兒則主要依靠肝臟產(chǎn)生）。機(jī)體缺氧是腎臟分泌EPO的基本動力，腎臟通過相應(yīng)細(xì)胞（腎皮質(zhì)細(xì)胞等）感受機(jī)體血氧濃度的變化，對EPO的產(chǎn)生進(jìn)行調(diào)控，從而參與紅細(xì)胞生成的過程。（見圖1）即一旦機(jī)體表現(xiàn)缺氧（由貧血，血容量減少等引起），腎臟便分泌大量EPO進(jìn)入血液，隨血液循環(huán)到達(dá)骨髓，作用于造血干細(xì)胞，促使紅細(xì)胞增生，直到紅細(xì)胞的攜氧量達(dá)到機(jī)體正常水平為止；而當(dāng)機(jī)體接受血液輸入時，由于大量紅細(xì)胞的涌入，導(dǎo)致血氧濃度提高，就會抑制腎臟EPO的產(chǎn)生。鑒于EPO在體內(nèi)的作用巨大而天然來源卻十分有限（主要由貧血病人的尿中提?。?，人們開始利用基因重組技術(shù)進(jìn)行重組EPO的研究。人體內(nèi)

6、EPO不是一種均一的分子，而是由不同的糖化體構(gòu)成，各種糖化體的區(qū)別主要表現(xiàn)在糖基在整個分子中所占比例的不同。而這個比例也正是重組EPO是否具有生物活性的關(guān)鍵。1988 年，具有與天然EPO近乎相同生物活性的重組EPO（rhEPO）出現(xiàn)了。它的肽鏈來源于基因的重組和表達(dá)：人體肝細(xì)胞的EPO基因片段由啟動子構(gòu)建成表達(dá)載體后，以不同的細(xì)胞株（有中國蒼鼠卵細(xì)胞（CHO）、幼蒼鼠腎細(xì)胞（BHK）及C127小鼠纖維細(xì)胞前體細(xì)胞系等6）作為受體進(jìn)行表達(dá)，獲取重組EPO。所以rhEPO的氨基酸序列與正常EPO完全相同，僅有糖基部分有微小的差別。Eisuke Tsuda 7，Dongmi Choi4及Henri

7、k Rahbek-Nielsen等人8分別通過高效液相色譜（HPLC）、核磁共振（1HNMR）、質(zhì)譜（MS）等手段發(fā)現(xiàn)：rhEPO比正常EPO含有更多的三分支(trianttennary oligosaccharide)及四分支(tetraanttennary oligosaccharide)低聚糖，并且二者在唾液酸化程度上有明顯的差別。但P. L. Storring9卻指出，rhEPO與EPO在不同分支低聚糖的含量上并無多大差異。因此，rhEPO與EPO在結(jié)構(gòu)上可以肯定的不同之處是N-端唾液酸的含量。由于rhEPO與EPO具有基本相同的生物活性，都能促使紅細(xì)胞增生，提高機(jī)體的血紅蛋白（Hb）

8、，改善機(jī)體的攜氧能力，所以臨床上主要用它來治療腎性貧血（因腎功能受損，導(dǎo)致EPO分泌不足）以及一些并發(fā)性貧血；而競技體育中對EPO的濫用則主要源于其改善機(jī)體攜氧能力的特點(diǎn)。相應(yīng)的EPO檢測技術(shù)也正是基于上述這兩個領(lǐng)域的要求而發(fā)展起來的。三、臨床EPO的檢測臨床上對腎性貧血的治療最初采用輸血和利用從尿液中提純的EPO進(jìn)行替代治療等方法，這些方法資源有限、安全性差。自rhEPO出現(xiàn)以來，這種狀況得到了很大的改善。國外臨床統(tǒng)計(jì)表明：rhEPO可以逆轉(zhuǎn)絕大多數(shù)血液透析患者的貧血癥狀，療法的有效率為100%，治愈率高達(dá)90%。近年來，rhEPO不僅用于臨床上腎性貧血的治療，而且已經(jīng)被應(yīng)用于各種慢性貧血、

9、惡性腫瘤、免疫疾病及AIDS等伴隨的貧血。1甚至還有學(xué)者10報道rhEPO在治療皮膚潰瘍方面也有一定的作用。隨著rhEPO藥效的不斷拓寬，以診斷、治療為目的的臨床EPO檢測技術(shù)也相應(yīng)地得到了發(fā)展。EPO的臨床檢測主要在于測定血清或尿樣中EPO的含量，借此判斷機(jī)體內(nèi)EPO水平是否正常。自1977年Miyake和Coworkers11從再生障礙性貧血病人的尿樣中提純了EPO之后，大量檢測EPO的方法也隨之產(chǎn)生。Congote12用兩根鍵合的C18柱與另一根硅鍵合的預(yù)分離柱連接，以乙睛-水-三氯乙酸為洗脫劑，用反向萃取富集EPO及其轉(zhuǎn)化體，并以反相色譜柱進(jìn)行分離測定；Soga和Ogino13使用液相

10、色譜（LC）在C18柱上分離鑒定EPO;Thorn等14則選用電泳的方法。但就臨床應(yīng)用而言，EPO的測定主要經(jīng)歷了三個階段：生物體內(nèi)測定法；生物體外測定法；免疫測定法20。其中后期發(fā)展起來的免疫測定法是目前應(yīng)用最廣泛的臨床檢測EPO的方法。免疫測定法以抗原、抗體反應(yīng)的特異性和親和性為基礎(chǔ)，具有快速、靈敏、簡易的特點(diǎn)。放射免疫法（RIA）是其中發(fā)展較早的一種方法，其靈敏度和準(zhǔn)確性均很高，是人體內(nèi)EPO濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)方法最初關(guān)于人體內(nèi)正常EPO濃度的測定基本上都采用這一方法。15-1890年代以來，不少學(xué)者又結(jié)合新技術(shù)，對其進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)： Roberts-D等人19通過血樣的前處理，改進(jìn)常規(guī)R

11、IA檢測，提高EPO檢測的靈敏度。而隨著EPO-RIA試劑盒的出現(xiàn)，使該方法的操作更加簡易，但由于RIA法畢竟涉及放射性元素，對人體不利，所以目前具有同樣準(zhǔn)確性和靈敏度的非放射免疫法更受廣大學(xué)者的青睞。非放射免疫法主要包括酶免分析法（包含EIA與ELISA）、熒光免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。酶聯(lián)免疫法沒有放射性，并且在顯色機(jī)理和方法的選擇上比較靈活（目前見于報道的有ELISA 法21）。但由于酶法建立在光度法基礎(chǔ)上，受顯色劑有限的吸光度和動力學(xué)范圍的限制，故靈敏度不高。因此Rossi-R等22在檢測中以單克隆抗體代替以往的多克隆抗體，使酶聯(lián)免疫法的靈敏度得到進(jìn)一步的提高，對體液中EPO含

12、量的檢測達(dá)到了10-11M的靈敏度（與放免法相當(dāng)）。熒光免疫檢測（FIA）是非放射免疫法中靈敏度最高的，它常用來檢測含量很低的生物活性物質(zhì)。近年來利用特殊的熒光探針，建立有效的FIA法對EPO進(jìn)行檢測也成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)，如從螺旋藻中提取藻膽蛋白作為熒光探針等44。此外化學(xué)放光免疫分析（CLIA）是另一個較為活躍的研究領(lǐng)域，它具有靈敏度高、本底低的特點(diǎn)。且CLIA的靈敏度一般均高于酶免疫分析法。目前已有利用CLIA原理制成了試劑盒出售。隨著免疫分析的不斷發(fā)展，一些新的分析手段和方法不斷出現(xiàn)，尤其關(guān)于試紙條的設(shè)想，使免疫分析法更具有廣闊的發(fā)展前景。四、競技體育中的EPO 檢測在競技體育中耐力

13、型項(xiàng)目的成績很大程度上取決于運(yùn)動員自身獲取和利用氧的能力，研究表明：提高人體內(nèi)攜氧紅細(xì)胞的數(shù)目，能相應(yīng)增加傳輸?shù)郊∪庵械难?。所以為了在比賽中取得更好的成績，一個常用并且為人們所認(rèn)可的方法是：運(yùn)動員進(jìn)行長年累月的持續(xù)訓(xùn)練（如高原特訓(xùn)、低壓氧艙等），從而使自身的最大攜氧量獲得每年1-2%的提升。但 EPO的出現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)這一結(jié)果提供了一條“捷徑”，澳大利亞運(yùn)動研究所的研究指出：使用EPO后，運(yùn)動員在四周內(nèi)攜氧量平均增加7%，最大的可達(dá)15%。另有研究證實(shí)EPO可引起最大攜氧量、血細(xì)胞壓積、力竭時間的提高，進(jìn)而極大地提升運(yùn)動員耐力運(yùn)動的能力。這一切促使某些運(yùn)動員放棄長期的艱苦訓(xùn)練，濫用EPO(主要是rh

14、EPO)以提高自身的最大攜氧能力。但rhEPO并非是無害的，臨床醫(yī)學(xué)證實(shí)使用過量rhEPO對人體會造成不可忽視的傷害：它通過促使紅細(xì)胞額外增加，紅細(xì)胞壓積（Hct）急劇上升，造成血液流動變緩，凝血加快，增加了靜脈血栓、肺栓塞、肌肉感染、中風(fēng)以及高血壓、癲癇的突發(fā)幾率。九十年代以來，自行車等耐力項(xiàng)目賽場上運(yùn)動員的突然死亡事件不斷增多，人們開始懷疑EPO在競技體育中的濫用，但由于缺少正常人關(guān)于rhEPO過量的數(shù)據(jù)，始終無法確證這一切與EPO有關(guān)；直到1998年法國邊境檢查人員意外發(fā)現(xiàn)著名的Festina自行車隊(duì)教練車中裝有大量rhEPO，才使運(yùn)動員濫用EPO的現(xiàn)象公布于眾。而針對rhEPO的檢測研

15、究始于1989年國際奧委會將包括EPO在內(nèi)的四種人工合成激素正式列為違禁藥物23興奮劑之后。近年來，隨著rhEPO濫用的愈演愈烈，與其相關(guān)的檢測研究更是引起了人們廣泛的關(guān)注。1競技體育中EPO檢測的重點(diǎn)及難點(diǎn)在興奮劑檢測中，EPO屬于內(nèi)源性物質(zhì)，即人體自身含有的物質(zhì)，按照一般的檢測思路，如果能確定一個EPO的正常含量范圍，凡是超出該范圍，便可判為陽性。但由于體內(nèi)EPO含量的個體差異很大，甚至個體本身EPO值也隨缺氧、貧血、pH值、運(yùn)動狀態(tài)以及晝夜節(jié)律的變化而變化，所以難于界定出這樣一個范圍。因此EPO的檢測關(guān)鍵在于區(qū)分內(nèi)源性（自身分泌）和外源性（從外部人為攝入）EPO。而外源性EPO，雖然理論

16、上也可使用來自人類血液（或尿液）提純的EPO，但因臨床上無制劑且費(fèi)用昂貴，目前，檢測主要只針對rhEPO。由于EPO本身的生理特性，檢測外源性EPO有眾多困難：1.EPO在體液中含量低。正常人體液中EPO的含量僅為每毫升納克級，（血液中為130-230ng/mL。4）2. EPO與rhEPO結(jié)構(gòu)相似。4兩者具有完全相同的氨基酸序列，僅N端所接的糖基略有差別。3. EPO在血液中的半衰期短。一般報道靜注為小時。4（也有報道稱小時24）。若按照一般運(yùn)動員的注射量U/L計(jì)算，則距離最后一次注射天后，EPO便檢測不到了。254. 個體之間及個體本身的EPO濃度差異很大。262. 競技體育中EPO的檢測

17、技術(shù)基于以上這些難點(diǎn)，針對興奮劑應(yīng)用的EPO檢測發(fā)展緩慢，直到年以后，才逐漸出現(xiàn)了一些突破性的進(jìn)展，到2000年，國際奧委會撥款100萬美元在全球試用“EPO 2000”計(jì)劃（由澳大利亞等國設(shè)計(jì)，準(zhǔn)備在2000年奧運(yùn)會上執(zhí)行的檢測EPO的方法），才正式啟動了EPO的檢測。而近年來陸續(xù)發(fā)展起來的EPO興奮劑檢測技術(shù)，概括起來可以分為間接法和直接法兩大類。21 間接法 間接法類似于逆向思維，它避開外源性EPO與內(nèi)源性EPO很難區(qū)分的主要矛盾，基于動態(tài)平衡的原理，認(rèn)為一旦外來EPO進(jìn)入體內(nèi)，其促使引發(fā)的新生紅細(xì)胞必然會打破血液系統(tǒng)內(nèi)部的平衡，而當(dāng)新的平衡建立時，各個血液學(xué)的參數(shù)指標(biāo)就一定會有相應(yīng)的變

18、化，所以只要找出能夠敏銳指示外源性EPO 進(jìn)入的間接性指標(biāo)，就可以在一定程度上對EPO的濫用實(shí)行監(jiān)控了。為了找出外源性EPO在體內(nèi)留下的間接性證據(jù)，各國學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，先后提出了單指標(biāo)檢測和多指標(biāo)檢測等方案。211 單指標(biāo)檢測 單指標(biāo)檢測最早源于Conconi等27人的研究。他們發(fā)現(xiàn)EPO經(jīng)皮下（30U/L）隔天注射并持續(xù)30-45天后，紅細(xì)胞壓積（Hct）,紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC），血紅蛋白（Hb）及大而空細(xì)胞含量(MacroHypo%)均明顯增加。尤其以MacroHypo%最為顯著（從0.06±0.09%到0.48±0.63%）。因此Conconi認(rèn)為MacroHyp

19、o%是較好的血液形態(tài)學(xué)指標(biāo)。 國際自行車聯(lián)盟（Cycling Union）首先以紅細(xì)胞壓積（Hct）作為EPO的一項(xiàng)監(jiān)控指標(biāo)，規(guī)定Hct大于的運(yùn)動員不準(zhǔn)參賽。28但這個指標(biāo)主要是出于保護(hù)運(yùn)動員安全的目的而定的，并非是興奮劑檢測的判據(jù)。研究表明：當(dāng)Hct超過，人體的血液將會變得極其粘稠，當(dāng)心臟竭力推動血液循環(huán)時，易導(dǎo)致心臟病的發(fā)作和中風(fēng)。28（早先運(yùn)動員的突然死亡事件極有可能是這個原因造成的。）而Schmidt等29于年通過對33名志愿者的測試發(fā)現(xiàn)：Hct并不存在一個常值，而是受鍛煉，姿勢，營養(yǎng)及脫水程度等多種因素影響。所以用單一的Hct指標(biāo)作為EPO檢測的依據(jù)顯然不夠充分，有時會出現(xiàn)誤判。但自

20、行車聯(lián)盟的這一規(guī)定對rhEPO的濫用還是起到了一定的抑制作用。 年，Gareau等30發(fā)現(xiàn)EPO的使用會對凝血系統(tǒng)產(chǎn)生影響。一般認(rèn)為凝血的機(jī)制在于溶膠狀態(tài)的纖維蛋白原在凝血酶的作用下轉(zhuǎn)化為凝膠狀態(tài)的纖維蛋白。31Gareau等經(jīng)過對腎透析病人的研究證實(shí)，人類尿樣中纖維蛋白與纖維蛋白原的總降解產(chǎn)物（TDP）基本是一個常數(shù)，注射EPO后，TDP會顯著增加。因此，他認(rèn)為尿樣中的TDP可作為指示使用外源性EPO的一項(xiàng)指標(biāo)。 鑒于血紅蛋白的結(jié)構(gòu)中含有鐵元素，Bressalle等32指出：當(dāng)EPO促使新生紅細(xì)胞成熟時，必然伴隨著血液中可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（sTfR）的增加。因?yàn)閟TfR結(jié)合富含鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白，

21、并將鐵轉(zhuǎn)移至血紅蛋白的卟啉環(huán)中，當(dāng)新的血紅蛋白合成后，sTfR便經(jīng)水解被釋放到血液中。年，Berkeland-Kare-I等33通過進(jìn)一步的研究指出注射EPO后，Hct在天后停止增加，而sTfR在天后仍處于異常增長狀態(tài)。也就是說如果注射EPO的運(yùn)動員盡管比賽前停止用藥，而且在參賽時，血液中的多數(shù)指標(biāo)（如Hct等）已恢復(fù)正常，但sTfR仍會處于異常狀態(tài)。因此，sTfR是一個比較理想的判斷濫用EPO的指標(biāo)。單一的間接指標(biāo)在EPO的檢測中為人們開拓了思想，對濫用EPO現(xiàn)象起到了一定的警示作用；可是單一指標(biāo)的缺陷也是明顯的：一些個體之間的差異以及海拔，運(yùn)動等因素均會使其中的一，兩個指標(biāo)發(fā)生變化。因此為

22、了加強(qiáng)間接法的有效性，一些學(xué)者開始建議使用多指標(biāo)（或綜合指標(biāo)）檢測。212 多指標(biāo)檢測年，Robin Parisotto34與澳大利亞體育藥檢實(shí)驗(yàn)室合作，對名受試者的分組研究，總結(jié)出了個可用于共同判斷EPO濫用的綜合指標(biāo)：網(wǎng)織紅細(xì)胞壓積(RetHct-reticulocyte hematocrit)，可溶轉(zhuǎn)鐵蛋白含量(sTfr)，EPO含量，紅細(xì)胞壓積(Hct)及巨紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(macrocytes%)。他們的實(shí)驗(yàn)表明，這個指標(biāo)可檢出正使用和已停使用個月以內(nèi)的EPO濫用者。為了進(jìn)一步提高這些指標(biāo)的準(zhǔn)確性，在實(shí)際運(yùn)用中，Robin他們又將個指標(biāo)歸并成一個統(tǒng)計(jì)學(xué)的模型：（1）：Score=3.72

23、1Hct+30.45RetHct+0.1871ln(EPO)+0.1267ln(sTfr)+0.115ln(macro%+0.1)（2）：Score=6.149Hct-92.87RetHct-0.1463ln(EPO)其中1式用于檢測正在使用EPO的濫用者，若該式所得值大于2.66（男性）/2.40（女性），則可判為陽性；2式用于檢測近期（2-4周內(nèi)）突然停用EPO的濫用者，當(dāng)該式所得值大于2.29（男性）/2.10（女性），便可判為陽性。這一模型從數(shù)學(xué)角度增強(qiáng)了該檢測方法的科學(xué)性，同時使檢測具有一個可用于衡量的簡單指標(biāo)。因此這一方法也成為了 EPO 2000計(jì)劃的重要基石。多指標(biāo)檢測的出現(xiàn)在

24、一定程度上防止了單一指標(biāo)的片面性，然而要作為一種承擔(dān)法律責(zé)任的檢測指標(biāo)，仍無法使人確信無疑。因?yàn)椴徽撎厥馇樾蔚母怕视卸嘈。\(yùn)用間接指標(biāo)進(jìn)行EPO的評價不夠直接。畢竟所有這些血液學(xué)的分析和生化參數(shù)的指標(biāo)都僅能指示紅細(xì)胞的生成被促進(jìn)了，但始終無法確證（運(yùn)動員）是否真的注射了外源性EPO。35研究表明，某些基因的突變也會造成紅細(xì)胞生成的加速。年，Juvonen E等36便報道了一個常染色體顯性促紅細(xì)胞生成的家族，而該家族成員也確實(shí)借助其先天的優(yōu)勢獲得過奧運(yùn)會冠軍和世錦賽耐力項(xiàng)目的優(yōu)勝。而除了這種先天因素，許多的其它因素（如高原訓(xùn)練）也會造成間接性指標(biāo)的超標(biāo)，這是間接法不能單獨(dú)作為EPO檢測依據(jù)的根本

25、原因。所以，Schmidt29指出：若是要以反興奮劑為宗旨的話，所有這類檢測（間接的）終究不能取代直接檢測外源性EPO的重要性。22 直接法EPO檢測的直接法提出時間與間接法差不多。1990年，瑞典教授Leif Wide37利用凝膠電泳對89個血樣（來自78名受試者）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)個人晚上的EPO的電荷比清晨要偏負(fù)一點(diǎn)，而新生兒與貧血者的EPO電荷則負(fù)于正常人。這種EPO帶不同電荷的性質(zhì)使Wide 獲得了很大的啟示。1995年，Leif Wide38又觀察到rhEPO與正常內(nèi)源性的EPO相比存在一個較低的負(fù)電荷。初步研究認(rèn)為可能是分子中所含唾液酸殘基數(shù)量的不同所造成的，也可能是胺基化等其他原因

26、引起分子整體電荷的差異。但不管如何，這種差異卻給EPO的直接檢測指明了方向。Wide借助瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行電泳，再利用RIA法使各成分在陰極獲得指示并檢出，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與判斷一致：rhEPO（包括一些異構(gòu)體）比正常EPO（包括異構(gòu)體）晚出峰。而且，該方法在小時以內(nèi)EPO的檢出率達(dá)，小時以內(nèi)達(dá)。年法國國家反興奮劑實(shí)驗(yàn)室的Francoise Lanse35又將方法改進(jìn)為等電聚焦配合以化學(xué)發(fā)光為指示劑的免疫雙印跡法，通過對102份凍存尿樣的研究證實(shí)：由于rhEPO與EPO在電荷上的差別，rhEPO在等電聚焦電泳中會出現(xiàn)附加的堿性條帶，而內(nèi)源EPO則沒有。所以只要將檢測者的尿EPO圖與正常內(nèi)源EPO的圖相比

27、較，便可進(jìn)行判斷。而且該方法的誤檢率僅為十萬分之六到萬分之三，是一種檢測近期使用rhEPO的理想方法。近年來，也有人39-41開始嘗試以HPCE（高效毛細(xì)管電泳）的方法從尿樣中分離測定rhEPO及其異構(gòu)體，雖然尚有一些問題需要解決，如某些異構(gòu)體的波峰重疊以及具體的工作條件有待于進(jìn)一步檢驗(yàn)等，但它對于EPO的直接檢測無疑是有幫助的。隨著直接檢測EPO方法的建立，同時也確立了以尿樣為檢測對象的模式。Wide在證實(shí)rhEPO與EPO電荷差異的實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步指出尿樣中EPO比血液中EPO更顯酸性，即尿樣在電泳速度上會更加有利。另外，Remacha-A-F等42也指出注射EPO后，尿樣中EPO的增加（由

28、15.4±9.6%到26.1±6.2%）比血液中（由19.8±4.1%到21.2±4.9%）要大。但是，事實(shí)上以尿樣作為檢測對象的主要原因還是考慮到尊重不同地區(qū)、宗教、民族的運(yùn)動員習(xí)俗的需要。并且從保護(hù)身體健康的目的出發(fā)，尿檢也要比血檢更容易使人接受。 直接法的出現(xiàn)對于競技體育中的EPO檢測是一次重大的突破，但是其本身還是具有難以調(diào)和的矛盾。傳統(tǒng)的凝膠電泳，由于受焦耳熱的限制，只能在低電場下進(jìn)行操作，所以分離時間長，效率低。根據(jù)Wide的實(shí)驗(yàn)，當(dāng)時他用1.3*67cm的瓊脂糖凝膠柱，在50mA的工作電流下，分離rhEPO與EPO花了20小時，這個時間對于

29、不到10天，但擁有近萬名運(yùn)動員的奧運(yùn)會而言，顯然是太慢了。而新興的HPCE，盡管在檢測速度上只需要20-30分鐘（其電壓可達(dá)21.0kV40），可基本符合檢測的要求，然而其nl級的進(jìn)樣要求，對于含量并不高的尿樣而言，濃縮的工作量是巨大的。當(dāng)Wide進(jìn)行傳統(tǒng)的凝膠電泳時，將10ml試樣濃縮至1ml，使用超濾共花了18小時，盡管HPLC在EPO檢測上的應(yīng)用目前尚處于研究階段，但前處理的時間也不容樂觀。因此，目前人們對EPO檢測采取的是直接法與間接法結(jié)合使用。2000年，悉尼奧運(yùn)會便是采用這一模式，通過血檢加尿檢的方法：首先利用血檢進(jìn)行粗篩，借助Robin等提出的項(xiàng)指標(biāo)取得一個綜合值，將其與正常值比

30、較，挑出可疑者，然后將可疑者的尿樣進(jìn)行電泳，實(shí)施直接檢測。比較上文的各種方法，這種模式應(yīng)該是眼前所能采用的最具有效率和說服力的檢測形式，在一定程度上解決了競技體育中EPO檢測的難題。五、EPO檢測的方向和展望 EPO的檢測發(fā)展至今，不論是在臨床上，還是在競技體育中，都獲得了極大的進(jìn)展。而且EPO的檢測是檢測肽類、蛋白類、糖蛋白類激素的一種探索，對于這些難以用常規(guī)檢測的色譜學(xué)（如GC/MS）方法檢測的物質(zhì)，EPO的檢測是一種啟發(fā)。但是為了配合更快，更高（靈敏度），更簡潔的目標(biāo)，EPO的檢測研究并未就此止步。David J等28提出利用rhEPO與EPO在碳同位素比例上的不同或許也能檢測rhEPO

31、。另一方面，EPO類內(nèi)源性新型興奮劑的潛在性也增加了EPO檢測所面臨的挑戰(zhàn)。據(jù)稱已經(jīng)有人開始嘗試全氟化碳（又稱合成血液，通過增加單個血紅細(xì)胞的載氧能力而不是增加血紅細(xì)胞的數(shù)目）以及基因EPO等模擬EPO增加攜氧能力的特征而設(shè)計(jì)的興奮劑。盡管這些興奮劑極有可能已擺脫了EPO的原有形式，但若EPO的檢測能揭示出具有這一類"興奮機(jī)理的共同特征，則對建立更有效，更迅速的EPO檢測方法和反興奮劑的斗爭都會有很大的幫助，這必將成為新一輪EPO檢測研究的熱點(diǎn)。參考文獻(xiàn)1 趙長安，李恩；中華血液學(xué)雜志，1993（14）5：270-2712 Lai P. H. , Evertt R., Wang F.

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