小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的研究進(jìn)展

1、小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的研究進(jìn)展【摘要】 小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell , ES cell）體外培養(yǎng)可以分化成為外胚層組織，并進(jìn)一步分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞已用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞替代治療和治療藥物的研發(fā)。小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法主要有擬胚體介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化、基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化、默認(rèn)模式介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化、單層粘附培養(yǎng)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化和遺傳工程介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化等。本文綜述了這些分化方法。【關(guān)鍵詞】 胚胎干細(xì)胞; 神經(jīng)細(xì)胞; 分化 Progress in directed differentiation of mou

2、se embryonic stem cells into neural cells 【Abstract】 Mouse embryonic stem cells can give rise to ectodermal derivatives in culture and can be further induced into neurons and glia for cell-replacement therapies in the central nervous system and for use in drug discovery. The methods of directed diff

3、erentiation of mouse embryonic stem cells into neural cells include neural differentiation from embryonic stem cells via embryoid bodies, stromal cell induced neural differentiation, default model mediated neural differentiation, adherent monoculture induced neural differentiation, genetic engineeri

4、ng mediated neural differentiation and so on. Here we review these methodologies.【Key words】 embryonic stem cell; neural cell; differentiation 小鼠胚胎干細(xì)胞于1981年首次由Evans和Kaufman1成功分離建系，它們來源于胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass , ICM），這些細(xì)胞具有穩(wěn)定的二倍體核型，在體外可以分化為三個胚層的多種細(xì)胞。將小鼠胚胎干細(xì)胞重新植入胚泡可以參與形成胚胎。體外ES細(xì)胞維持未分化狀態(tài)依賴于一些細(xì)胞因子的存在，如白

5、血病抑制因子（leukemia inhibitory factor , LIF）2。撤去這種自我更新的刺激信號后，ES細(xì)胞很快分化為多種細(xì)胞。這些屬性使ES細(xì)胞成為非常有用的發(fā)育生物學(xué)和功能基因組學(xué)研究的生物系統(tǒng)3。1 擬胚體（embryoid bodies, EBs）內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的分化 小鼠ES細(xì)胞通過擬胚體分化為神經(jīng)細(xì)胞主要有以下兩種方案。1.1 “4-/4+方案”4 將小鼠ES細(xì)胞無LIF培養(yǎng)4天，形成EB；再用維甲酸（retinoic acid, RA）處理4天，然后在明膠（gelatin）5或?qū)诱尺B蛋白（laminin）4包被的組織培養(yǎng)皿上培養(yǎng)6。培養(yǎng)6天后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)

6、，開始表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異的基因，如神經(jīng)微絲輕鏈（neurofilament light chain）、微管相關(guān)蛋白2和5（MAP2、MAP5）等。這些細(xì)胞對一系列神經(jīng)遞質(zhì)和去極化電流起反應(yīng)，證實(shí)了它們是可以傳遞興奮的神經(jīng)元。這一方案還會分化出神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，多數(shù)為星形膠質(zhì)細(xì)胞，但也有少突膠質(zhì)細(xì)胞的存在7。RA是一類促神經(jīng)生長因子，不僅對多潛能干細(xì)胞有誘導(dǎo)作用，對神經(jīng)前體細(xì)胞也有促進(jìn)增殖、成熟的作用。RA與受體RAR、RXR結(jié)合，后者活化后與RA反應(yīng)元件（RARE）結(jié)合，激活神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)基因并抑制中胚層相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄8。Wiles 等人的實(shí)驗(yàn)表明RA通過激活抑胰蛋白（follistatin）抑制骨形

7、態(tài)形成蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）而使小鼠ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化9。 該方案時間短、成本低，是目前使用較為廣泛的神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)方法。其不足之處是EB的外層細(xì)胞先分化而內(nèi)層細(xì)胞仍保持未分化狀態(tài), 分化不均一，得到的細(xì)胞種類復(fù)雜，不利于純化。1.2 “五步法”方案10 (1)擴(kuò)增未分化的胚胎干細(xì)胞；(2)去除分化抑制劑或促有絲分裂素，ES細(xì)胞開始分化，不貼壁懸浮生長，形成EB；(3)去除生長因子，選擇巢蛋白（nestin）陽性細(xì)胞（即神經(jīng)前體細(xì)胞）；(4)使用神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液，添加生長激素、神經(jīng)營養(yǎng)因子，擴(kuò)增神經(jīng)前體細(xì)胞；(5)利用促神經(jīng)元存活因子誘導(dǎo)并維

8、持神經(jīng)元成熟。該方案不用RA處理EB，而是將EB在一種選擇性的無血清培養(yǎng)基上培養(yǎng)。因?yàn)镋B中的非神經(jīng)細(xì)胞不能在這種培養(yǎng)條件下生存，所以大部分存活下來的細(xì)胞是nestin陽性的神經(jīng)前體細(xì)胞11。這些神經(jīng)前體細(xì)胞可被高效地誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元12。 該方案的主要優(yōu)點(diǎn)是在進(jìn)一步分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之前，神經(jīng)前體細(xì)胞已經(jīng)得到較高的純化，這有利于特定類型神經(jīng)細(xì)胞的獲得。但是，其操作較“4-/4+方案”復(fù)雜，而且多種生長激素、神經(jīng)營養(yǎng)因子的應(yīng)用增加了成本且不利于分化機(jī)制的闡明。通過EB途徑由ES細(xì)胞分化而來的神經(jīng)元多數(shù)為-氨基丁酸（GABA）能神經(jīng)元，少數(shù)是谷氨酰胺能神經(jīng)元。通過改變誘導(dǎo)分化的條件，可以

9、得到不同類型的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并提高分化效率。腹側(cè)中腦和后腦是多巴胺能神經(jīng)元和5-羥色胺能神經(jīng)元產(chǎn)生的部位，SHH(sonic hedgehog)和FGF-8（fibroblast growth factor-8）對這兩部分的形態(tài)發(fā)生起重要作用13，Lee等人10用這兩種分子處理EB來源的神經(jīng)前體細(xì)胞得到了多巴胺能神經(jīng)元和5-羥色胺（5-HT）能神經(jīng)元。 2002年Wichterle等人14用背側(cè)分子（RA）和腹側(cè)分子（Hh-Ag1.3,一種SHH的拮抗劑）處理EB，得到了腹側(cè)脊髓運(yùn)動神經(jīng)元。2005年Tsuchiya等人15在經(jīng)典的“五步法”方案基礎(chǔ)上，在第五步除去bFGF（basic

10、 fibroblast growth factor），用含有層粘連蛋白的N2培養(yǎng)液中成功誘導(dǎo)分化出微小膠質(zhì)細(xì)胞，并進(jìn)一步用含有胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和粒單細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的RPMI-1640培養(yǎng)液擴(kuò)增細(xì)胞，得到89.0%的微小膠質(zhì)細(xì)胞。2 基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的分化 第二類誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化的方法是基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)方法，該方法的誘導(dǎo)機(jī)制尚不清楚，目前稱為“基質(zhì)細(xì)胞來源的誘導(dǎo)活性作用（stromal cell-derived inducing activity , SDIA）”16。2000年Kawasaki等人描述了一種經(jīng)基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化

11、為多巴胺能神經(jīng)元的方法16。這一方法中，神經(jīng)細(xì)胞的分化通過ES細(xì)胞與小鼠骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞PA-6細(xì)胞單層共培養(yǎng)而實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，92%的細(xì)胞表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（nerve cell adhesion molecule, NCAM）陽性，其中多數(shù)為酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase, TH）陽性細(xì)胞。酪氨酸羥化酶是多巴胺生物合成的限速酶，因此是多巴胺能神經(jīng)元的一個很好的分子標(biāo)志。2005年Yamozoe等人17用含有肝素的磷酸鹽緩沖液沖洗培養(yǎng)的PA-6細(xì)胞得到含有所謂神經(jīng)誘導(dǎo)因子（neural inducing factors, NIF）的溶液，用此溶液培養(yǎng)小鼠ES

12、細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)小鼠ES細(xì)胞可以在含有33%NIF溶液的培養(yǎng)液中生存，并且隨著培養(yǎng)液中肝素濃度的增加，ES細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的比例也增高。值得注意的是，PA-6細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化受到血清或BMP-4的抑制，血清和BMP-4的加入可引起ES細(xì)胞分化為多種非神經(jīng)細(xì)胞。PA-6細(xì)胞的SDIA作用并不能使所有類型的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元，例如，2005年Roybon等人18報道，對于神經(jīng)前體細(xì)胞，PA-6細(xì)胞不能促進(jìn)其向多巴胺能神經(jīng)元分化，而是促進(jìn)其向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化。2003年Barberi等人19描述的一種經(jīng)基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法可以將ES細(xì)胞分別誘導(dǎo)分化為多種神經(jīng)細(xì)胞。這一方法將小鼠骨髓

13、來源的基質(zhì)細(xì)胞MS5或S17或主動脈-性腺-中腎區(qū)來源的原始基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞與ES細(xì)胞在血清替代培養(yǎng)液中共同培養(yǎng)，得到神經(jīng)前體細(xì)胞，再用不同的細(xì)胞因子序貫處理這些神經(jīng)前體細(xì)胞，分別可以得到較高百分比的膽堿能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、-氨基丁酸能神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。將得到的多巴胺能神經(jīng)元注射到6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森模型動物的患側(cè)紋狀體內(nèi)，8周后由中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑amphetamine或者紋狀體D1、D2受體激動劑apomorphine所誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)不穩(wěn)定癥狀得到了顯著改善，并且可以在注射細(xì)胞的紋狀體內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的酪氨酸羥化酶陽性細(xì)胞?；|(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分

14、化的方法可以高效獲得某種特定的神經(jīng)細(xì)胞，例如，多巴胺能神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元。然而，作用機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。3 默認(rèn)模式（default model）介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化2001年Tropepe等人20發(fā)現(xiàn)小鼠ES細(xì)胞在低密度、無血清、無飼養(yǎng)層細(xì)胞的條件下培養(yǎng)7天后，約0.2%的細(xì)胞可形成神經(jīng)球（neurosphere），并進(jìn)一步自發(fā)分化為神經(jīng)細(xì)胞，這種分化方法稱為默認(rèn)模式。這是抑制神經(jīng)分化的信號分子表達(dá)降低的結(jié)果。Wiles等人9發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)分化過程中，可以檢測到BMP、TGF等基因的表達(dá)下調(diào)。BMPs在神經(jīng)發(fā)育早期與細(xì)胞表面絲/蘇氨酸受體結(jié)合激活Smad蛋白，后者進(jìn)入核內(nèi)抑制Mash1、Mat

15、h1、Ngn1/2、NeuroD等轉(zhuǎn)錄因子的活性，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)分化21。BMP4處理的小鼠ES細(xì)胞在分化過程中神經(jīng)元數(shù)量大為減少22；而用 noggin、follistatin、chordin、Cerberus等BMPs的拮抗劑處理小鼠ES細(xì)胞則可促進(jìn)ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向的分化。該方法促進(jìn)神經(jīng)分化的效率較低，單獨(dú)應(yīng)用此法誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化并不多見。4 單層粘附培養(yǎng)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化2002年P(guān)achernk等人23在不形成EB和不用RA處理的情況下，將小鼠ES細(xì)胞生長在含有胰島素（insulin）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin）、硒元素（selenium）和纖連蛋白的無

16、血清DMEM/F12培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)分化的細(xì)胞多數(shù)表達(dá)MAP-2等神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白。2003年Ying等人24將細(xì)胞密度為0.51.5104/cm2的小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)于0.1%明膠包被的組織培養(yǎng)皿上，以N2B27作為培養(yǎng)液，培養(yǎng)4天后，60%以上的細(xì)胞分化為神經(jīng)前體細(xì)胞。該方法形成的神經(jīng)前體細(xì)胞具有良好的可塑性：神經(jīng)前體細(xì)胞在N2B27培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得到的細(xì)胞多數(shù)為GABA能神經(jīng)元；FGF8和SHH處理神經(jīng)前體細(xì)胞可以得到較多的多巴胺能神經(jīng)元。此類方法將形成EB的三維培養(yǎng)模式簡化為單層粘附培養(yǎng)的模式，降低了復(fù)雜程度，有利于神經(jīng)細(xì)胞分化早期事件的分子機(jī)制研究，而培養(yǎng)液中各成分發(fā)揮的作用需要進(jìn)一

17、步闡明。百事通 5 遺傳工程介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化2002年Chung等人25將Nurr1（nur相關(guān)因子1）基因?qū)胄∈驟S細(xì)胞，使其過表達(dá)，從而誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為具有中腦多巴胺能神經(jīng)元表型的細(xì)胞。Nurr1是一種轉(zhuǎn)錄因子，直接結(jié)合于TH基因的啟動子區(qū)域，調(diào)節(jié)維持中腦多巴胺能神經(jīng)元表型的蛋白質(zhì)的表達(dá)，如L-芳香族氨基酸脫羧酶（aromatic L-amino acid decarboxylase, AADC）、囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（vesicular monoamine transporter 2, VMAT2）26和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（dopamine transporter, DAT）27。將這種

18、方法得到的多巴胺能神經(jīng)元注射到腦內(nèi)可以改善帕金森模型大鼠的運(yùn)動缺陷28。該方法存在的問題是，在神經(jīng)細(xì)胞分化之前過表達(dá)Nurr1會上調(diào)其他多巴胺能神經(jīng)元分子標(biāo)志的表達(dá)，而且由ES細(xì)胞分化的其他細(xì)胞也會出現(xiàn)這種情況29。2004年Ikeda等人30將MASH1基因?qū)胄∈驟S細(xì)胞，該ES細(xì)胞多數(shù)分化為表達(dá)tubulin和泛NCAM（pan NCAM）的神經(jīng)元樣細(xì)胞，其中半數(shù)進(jìn)一步分化為Islet陽性的運(yùn)動神經(jīng)元。MASH1是一種激活型堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，表達(dá)于腹側(cè)端腦，調(diào)節(jié)GABA能中間神經(jīng)元和分支運(yùn)動神經(jīng)元的發(fā)育31。將得到的運(yùn)動神經(jīng)元樣細(xì)胞注射到偏癱小鼠腦室周圍的運(yùn)動皮層，可明顯

19、改善運(yùn)動障礙。遺傳工程介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞分化方法的優(yōu)勢是可以較高效率地得到感興趣的特定的神經(jīng)細(xì)胞。但是由于導(dǎo)入基因的功能多樣性和不確定性，較難判斷該基因?qū)?xì)胞的整體影響和長遠(yuǎn)影響。6 問題與展望雖然小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法取得了較大進(jìn)展，目前可以較高效率地得到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各種神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，但是仍有許多問題亟待解決。首先，雖然“五步法”方案解決了“4-/4+”方案中分化細(xì)胞不易純化的問題，但是其分子機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明、操作步驟需要進(jìn)一步優(yōu)化；其次，SDIA誘導(dǎo)方法的作用機(jī)制和單層粘附培養(yǎng)的作用機(jī)制需要進(jìn)一步闡明，這將會有利于我們對神經(jīng)細(xì)胞分化過程中信號通路的掌握；再次，遺傳工

20、程方法導(dǎo)入的基因?qū)?xì)胞的長遠(yuǎn)影響需要進(jìn)一步觀察和研究；還有，現(xiàn)在所得到的神經(jīng)細(xì)胞類型還不很明確，因?yàn)樯窠?jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞還可以分為很多亞型。例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)元根據(jù)形態(tài)和生化特性就可以分為不同亞型，它們的分布和生理功能也不盡相同。因此有必要獲得特定部位和類型的神經(jīng)細(xì)胞。ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的研究有利于人們了解胚胎神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育的機(jī)制、發(fā)現(xiàn)ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因；建立體外定向誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化體系將為神經(jīng)疾病治療藥物的篩選以及基因工程藥物的開發(fā)等提供有用的材料；體外大量有功能的特定神經(jīng)元的獲得使神經(jīng)再生醫(yī)學(xué)正一步步從理論走向?qū)嵺`?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Evans MJ,Kaufm

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