髓鞘堿性蛋白基因與多發(fā)性硬化相關(guān)性的研究

1、    髓鞘堿性蛋白基因與多發(fā)性硬化相關(guān)性的研究        【摘要】目的探討中國(guó)人群中多發(fā)性硬化（MS）的遺傳易患性與髓鞘堿性蛋白基因5端四核苷酸重復(fù)序列多態(tài)性的相關(guān)性。方法以28例確診MS患者及47名正常對(duì)照為研究對(duì)象，從外周血白細(xì)胞中提取DNA，利用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)特異性擴(kuò)增MBP基因5端四核苷酸重復(fù)序列，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種等位基因，片段大小為1.06 kb, 0.98 kb, 0.61 kb和0.54 kb，以前兩種多見。1.06

2、 kb基因片段在女性中出現(xiàn)頻率很高，達(dá)73%，MS組與對(duì)照組無差別。男性中1.06 kb基因片段出現(xiàn)頻率MS組(69%)明顯高于對(duì)照組(39%)。MS組中等位基因的分布無性別差異。結(jié)論中國(guó)人群中MBP基因第一個(gè)外顯子5端四核苷酸重復(fù)序列多態(tài)位點(diǎn)等位基因的分布有性別差異，1.06 kb的等位基因片段可能與MS易患性相關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】致腦炎堿性蛋白質(zhì)類多發(fā)性硬化基因聚合酶鏈反應(yīng)The association between myelin basic protein gene and multiple sclerosisZHANG Yanqing， XIE Ruping.Deptartment of

3、Neurology, The Third School of Clinical Medicine, Beijing Medical University, Beijing 100083【Abstract】Objective To investigate whether the polymorphism of the tetranucleotide repetitive sequence located 5 to the MBP gene exon 1 contributes to the susceptibility to multiple sclerosis in Chinese popul

4、ation. Methods Twenty-eight unrelated patients with multiple sclerosis and forty-seven control subjects were included in this study. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes and amplified using the polymerase chain reaction (PCR) to characterize the tetranucleotide repetitive seque

5、nce located 5 to the MBP gene first exon. The PCR product was analyzed through agarose gel electrophoresis. ResultFour alleles were obtained, with fragment size of 1.06 kb, 0.98 kb, 0.61 kb and 0.54 kb. Alleles with the size of 1.06 kb and 0.98 kb were most frequently seen. High frequency, 73%, of 1

6、.06 kb allele was observed in females no matter which groups (MS or control) they were in. Among males, the 1.06 kb allele was more frequently seen in MS group (69%) than in control group (39%). There was no difference in the distribution of these alleles between male and female patients with multip

7、le sclerosis. ConclusionThere is different distribution of the AmFLP (amplification fragment length polymorphism) alleles located 5 to the MBP gene exon 1 in male and female in Chinese population. The 1.06 kb allele may be associated with the susceptibility to multiple sclerosis.【Key words】Encephali

8、togenic basic proteinsMultiple sclerosis Genes Polymerase chain reaction多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見的慢性脫髓鞘疾病，病因至今未明。大量流行病學(xué)及統(tǒng)計(jì)資料表明，MS發(fā)生與環(huán)境、遺傳因素均有關(guān)1。迄今的研究支持MS是遺傳易患個(gè)體暴露于某種環(huán)境因素后而發(fā)生的自身免疫過程2。 髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）是髓鞘的重要組分，是誘發(fā) MS的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（EAE）的主要抗原。MBP基因是否為MS的易感基因尚無定論3-5。本研究

9、以中國(guó)MS患者為對(duì)象，旨在探討MBP基因是否與我國(guó)的MS遺傳易患性相關(guān)。對(duì)象和方法一、臨床資料1MS組：MS患者共28例，男8例，女20例，年齡1862歲，平均40歲，均為漢族人。是1996年11月至1998年2月北京醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院17例、北京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院4例、北京醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院6例、宣武醫(yī)院1例神經(jīng)科住院及門診患者。均符合Poser等6的MS診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者間無親緣關(guān)系。2對(duì)照組：共47例，男23例，女24例，年齡2589歲，平均46歲。均為漢族人, 個(gè)體間無親緣關(guān)系，為無神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病史及家族史的正常人。二、研究方法應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法7 從研究對(duì)象外周血白細(xì)胞中提取高分子量D

10、NA，利用PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增目的基因片段。上游引物為5GGTACATTACACCTAT-TTGG3, 下游引物為5GGATTCACTCACATA-TTCCT3。PCR條件為94變性50秒，54退火50秒，72延伸80秒，共35次循環(huán)。并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳來確定每一DNA擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小。三、統(tǒng)計(jì)分析 采用列聯(lián)表資料的2檢驗(yàn)，無效假設(shè)為MBP基因5端重復(fù)序列的AmFLP (擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)等位基因頻率無組間差異。結(jié)果一、MBP基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析應(yīng)用PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增了MBP基因5端的四核苷酸重復(fù)序列，并通過瓊脂糖凝膠電泳獲得了清晰可辨的四種大小的片段，每一種片段都是所擴(kuò)增位點(diǎn)的一個(gè)

11、等位基因。這四種等位基因片段大小分別為A1=1.06 kb, A2=0.98 kb, A3=0.61 kb, A4=0.54 kb (1) 。 1：0.61 kb純合子；2：1.06 kb/0.61 kb雜合子；3：1.06 kb/0.54 kb雜合子；4：相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；5：1.06 kb純合子；6、7為1.06 kb/0.98 kb雜合子1MBP基因5端四核苷酸重復(fù)序列AmFLP等位基因相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(4泳道)，由DNA EcoR I/Hind 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與1 085 bp相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)組成；其余各泳道均為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物二、相關(guān)性分析對(duì)28例MS患者及對(duì)照組的47名對(duì)象做了MB

12、P基因AmFLP 等位基因分析。A1及A2在實(shí)驗(yàn)對(duì)象中出現(xiàn)頻率較高，A3及A4僅個(gè)別出現(xiàn)。結(jié)果顯示:（1）女性MS組與對(duì)照組等位基因的分布無差別，A1最多見，達(dá)73%；（2）男性兩組的等位基因分布有顯著差別，MS組和對(duì)照組A1出現(xiàn)頻率分別為69%和39%，A2在兩組中出現(xiàn)情況與A1相反；（3）MS組等位基因分布無性別差異；（4）對(duì)照組等位基因分布的性別差異顯著，女性A1多見(73%)，男性A2多見(59%)，見表1。表1MBP基因AmFLP等位基因在對(duì)照組與MS組不同性別中分布差異的比較MBP等位基因?qū)φ战M染色體數(shù)(%)MS組染色體數(shù)(%)女a(chǎn)男b女a(chǎn)男bA1A235(73)10(21)29(

13、73)8(20)A32(4)1(2)3(7)0(0)A41(2)0(0)0(0)0(0)合計(jì)48(100)46(100)40(100)16(100)注：A3、A4數(shù)量極少, 故在統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)中忽略不計(jì)，僅進(jìn)行A1、A2分布差異的比較。a： 兩組女性的比較，2=0.04，P>0.05；b： 兩組男性的比較，2=3.92，P<0.05；c： 對(duì)照組男女間的比較，2=13.26，P<0.005 ；d： MS組男女間的比較，2=0.16，P>0.05討論實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了四種等位基因A1 (1.06 kb)、A2(0.98 kb)、A3(0.61 kb)、A4(0.54 kb)。由于A3、

14、A4僅在個(gè)別病人及對(duì)照組中出現(xiàn)，故無法分析其意義。本實(shí)驗(yàn)MS組女性患者占70%，在對(duì)照組女性占51%，而MS在女性中多見，性別組成比不同可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為了去除性別因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，將實(shí)驗(yàn)對(duì)象分為女性MS組、男性MS組、女性對(duì)照組和男性對(duì)照組四小組，前三組的等位基因分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，A1的頻率明顯高于A2，而在男性對(duì)照組中情況正相反，A2的頻率高于A1。對(duì)照組的資料提示MBP等位基因的分布有性別差異，A1大片段在女性中多見。而男性MS患者在A1、A2的頻率分布上與女性無差別，且男性MS患者A1大片段的頻率顯著高于對(duì)照組男性中A1的頻率，提示A1與MS相關(guān)。綜合以上分析，我們認(rèn)為MBP多態(tài)性

15、等位基因分布可能既與性別有關(guān)，又與MS疾病有關(guān)。與許多自身免疫疾病 (如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力)一樣，MS以女性多見，本實(shí)驗(yàn)中女/男比率為2.5。女性MS發(fā)病率高，且女性中A1出現(xiàn)頻率很高，這種平行關(guān)系以及男性中A1與MS相關(guān)，提示MBP基因可能與MS的易患性有關(guān)。因此我們假想，1.06 kb(A1)的MBP基因片段決定了女性對(duì)MS易患的一種遺傳素質(zhì)，而女性中可能還存在著另外一種或幾種保護(hù)因子，當(dāng)其存在時(shí)便會(huì)保護(hù)女性免于患病，缺乏保護(hù)因子則易患??；在男性中，1.06 kb的MBP基因片段出現(xiàn)頻率低，使得男性對(duì)MS不易患，由于性別差異的影響男性缺乏女性所具有的保護(hù)因子，因此1.06 kb基因

16、片段在男性中出現(xiàn)時(shí), 便更易發(fā)揮其決定對(duì)MS易患的作用。MBP基因5端四核苷酸重復(fù)序列是不是MBP基因功能的重要組成部分，以及該位點(diǎn)不同等位基因是否會(huì)影響MBP基因的表達(dá)，目前尚不清楚。另外，發(fā)現(xiàn)MBP基因多態(tài)位點(diǎn)與MS相關(guān)還不能充分說明它就是MS的易感基因，它也可能只是作為MBP基因功能編碼區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)的一種非特異性標(biāo)志，或是作為18號(hào)染色體上緊鄰MBP基因的其他基因的一種非特異性標(biāo)志，即該位點(diǎn)只是與MS易患基因 (可能是MBP基因的其他位點(diǎn)或其他基因)相連而已。實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)并非所有患MS女性都具有1.06 kb基因片段，也并非所有具1.06 kb片段純合子的男性都會(huì)患病，這也說明還有其他因子參

17、與MS發(fā)病，這與多種因子 (包括多基因、多種環(huán)境因子)1，8 參與MS發(fā)病的理論是一致的。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)了兩種小片段的等位基因 (A3-0.61 kb、A4-0.54 kb)，它們與A1-1.06 kb、A2-0.98 kb相差300500 bp，這在其他學(xué)者的研究中尚未見報(bào)道，這些小片段等位基因的出現(xiàn)有何種意義，是由何種突變?cè)斐傻?，尚有待于更深入廣泛的研究。作者單位：100083 北京醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科參考文獻(xiàn)1McDonald WI. The mystery of the origin of multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psy

18、chiatry, 1986,49:113-123.2Bansil S, Cook SD, Rohowsky Kochan C. Multiple sclerosis: immune mechanism and update on current therapies. Ann Neurol, 1995, 37 Suppl 1: S87-101.3Tienari PJ, Wikstrom J, Sajantila A, et al. Genetic susceptibility to multiple sclerosis linked to myelin basic protein gene. Lancet, 1992, 340:987-991.4Eoli M, Milanese C, Salmaggi, et al. The myelin basic protein gene is not a major Susceptibility locus for multiple sclerosis in Italian patients. J Neurol,