CD147分子在膽管癌浸潤及轉移中作用及機制的研究

1、CD147分子在膽管癌浸潤及轉移中作用及機制的研究 作者：賀偉旗，王曙光，顧建文，匡永勤，程敬民，邢學民，楊文濤，張俊?！菊?目的 了解CD147與膽管癌侵襲轉移的關系。方法 通過RTPCR和免疫熒光法了解CD147在膽管癌細胞株QBC939中的表達，然后構建反義CD147分子基因片斷的重組腺病毒抑制膽管癌細胞株CD147分子的表達，觀察其基質金屬酶MMPs改變及生長情況。結果 CD147分子在膽管癌細胞株QBC939中表達，表明反義CD147通過抑制腫瘤細胞的CD147分子的表達，主要減少了腫瘤組織中基質金屬酶MMP2，而不是MMP9的表達，導致腫瘤的生長抑制。結論 CD147分子的高表

2、達能夠促進膽管癌的腫瘤生長，并且CD147促進腫瘤生長的能力可能與MMP2的高表達密切相關。 【關鍵詞】 膽管癌；CD147；腫瘤轉移；MMP2；MMP9 Abstract: Objective To explore whether CD147 had involved in the metastasis and invasion of bile duct cancer or not.Methods The expression of CD147 in bile duct cancer cell strain QBC939 was surveyed by RTPCR and indirect

3、immunofluorescence. Then a recombinant adenoviral vector containing CD147 cDNA in an antisense orientation was constructed and transfected to QBC939. The matrix metalloproteinase (MMPs) and the growth of QBC939 with antisensed CD147 cDNA were tested. Results In this study, the expression of CD147 in

4、 human bile duct cancer cell strain QBC939 was confirmed by RTPCR and indirect immunofluorescence. The results showed that the antisensed CD147 can inhibit the invasion and metastasis of bile duct cancer cells by decreasing the expression level of MMP2,not MMP9.ConclusionThis study indicates that bl

5、ocking the molecule expression of CD147 may be an effective way to inhibit the development of the tumor. Keywords: bile duct cancer; CD147; metastasis 膽管癌可通過多種途徑轉移1。CD147是一種廣泛分布于多種細胞的屬于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily，IgSF)的跨膜糖蛋白。在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)有CD147表達的增高，并與腫瘤的浸潤和轉移相關。有學者從人肺癌LX1細胞膜上分離出來CD147MMP1復合物，說明C

6、D147不僅能刺激纖維母細胞產(chǎn)生MMP1，還能結合MMP1于腫瘤細胞表面，從而促進腫瘤的浸潤2。有研究表明，MMPs在膽管癌的浸潤及轉移中也起了很重要的作用34。而CD147是否參與調(diào)節(jié)膽管癌的浸潤及轉移過程，CD147刺激MMPs產(chǎn)生的作用及兩者的關系尚未見文獻報道。本研究設想對于MMP上游的CD147分子進行干預將會對膽管癌的生物學行為產(chǎn)生影響，從而對膽管癌的浸潤及轉移起到抑制或阻斷的作用。以膽管癌細胞株QBC939細胞為研究對象，首先了解CD147分子在其中的表達，并通過構建攜帶反義CD147分子的腺病毒載體，將其轉染膽管癌細胞株QBC939細胞，以觀察減少CD147分子信號通路對膽管癌

7、體外及體內(nèi)生物學行為的影響，探討CD147的表達與MMPs之間的關系及在膽管癌浸潤及轉移中的作用。1 材料與方法1.1 材料 實驗細胞株：人膽管癌細胞株QBC939由全軍肝膽外科研究所建立。實驗動物：健康純種SPF級BALB/C 6周齡雌性裸鼠15只，體重（24±3）g，購自上海藥物研究所實驗技術中心。實驗試劑：各種限制性內(nèi)切酶，T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、RTPCR試劑盒購自Roche公司。PCR產(chǎn)物試劑盒、小量質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA快速連接試劑盒購自寶生物公司。脂質體轉染試劑盒Lipofectin Reagent購自Invitrogen公司，A

8、dEasy XL Adenoviral Vector System試劑盒購自Stratagene公司。FITC標記和HRP標記的羊抗兔IgG、兔抗人CD147抗體、兔抗人MMP2抗體和兔抗人MMP2抗體購自武漢博士德公司。1.2 方法1.2.1 QBC939細胞中CD147 mRNA表達檢測（RTPCR）登錄Genebank根據(jù)人CD147的基因序列，運用Primer5軟件設計得到目的基因引物：5GAAGGAAGTGTATGATGGGAAT3和5GCGGTTGGAGGTTGTAGG3。提取培養(yǎng)72h的QBC939細胞總RNA，按RTPCR試劑盒說明書行cDNA鏈的合成和PCR擴增，所得到的PC

9、R產(chǎn)物通過凝膠電泳進行鑒定。1.2.2 免疫熒光法檢測QBC939細胞中CD147蛋白表達QBC939細胞培養(yǎng)72 h后，PBS洗滌3次，用4%的多聚甲醛固定。滴加未標記的兔抗人CD147抗體(1200)，37 孵育30 min后，PBS洗滌3次。加入FITC標記的羊抗兔IgG抗體(1100)，37 孵育30 min后，PBS洗滌3次，并置于熒光顯微鏡下觀察。1.2.3 反義CD147腺病毒載體的構建及擴增通過PCR方法擴增人全長CD147 cDNA片斷，擴增的cDNA連接到pGEM TEasy質粒中進行大量擴增。得到的CD147 cDNA片斷與pShuttleCMV質粒反向連接，連接后得到p

10、ShuttleCMVasCD147，同時轉DH5感受態(tài)菌株進行擴增、酶切和電泳鑒定。pShuttleCMVasCD147穿梭質粒在BJ5183菌株中與pADEasy質粒進行同源重組，將目的基因重組到腺病毒基因組質粒中得到pADEasyCMVasCD147質粒，同時進行克隆擴增和酶切鑒定。pADEasyCMVasCD147質粒轉染QBC939細胞，47 d后觀察細胞病變效應；收集病變的QBC939細胞和培養(yǎng)上清液反復凍融、離心后進行脫水濃縮得到重組腺病毒。1.2.4 Westernblotting檢測反義CD147轉染后QBC939細胞中CD147、MMP2及MMP9蛋白表達 將QBC939細胞

11、分為AdasCD147轉染組、AdLacZ轉染組和空白對照組。將各組細胞裂解蛋白進行SDS PAGE電泳后，半干法(1 mA/cm2，60 min)電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，加入兔抗人CD147抗體、MMP2及MMP9（1200），4 過夜，1TBST洗膜，加入HRP標記羊抗兔IgG（15 000），37 孵育1 h，1TBST洗膜，化學發(fā)光試劑檢測。1.2.5 裸鼠荷瘤實驗將6周齡雌性BALB/C裸鼠15只，隨機分為3組：PBS對照組、AdLacZ組和AdasCD147組，每組5只。分別取對數(shù)期生長的PBS對照組、AdLacZ轉染組和AdasCD147轉染組QBC939細胞懸液，

12、調(diào)整到細胞數(shù)5×107/mL后，每只裸鼠皮下接種0.2 mL細胞懸液。接種1周后用游標卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（S2），計算腫瘤的體積（V），計算公式為V=L×S2×0.4。1.3 統(tǒng)計學處理 SPSS 11.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計及檢驗，結果用均值±標準差(±s)表示。各組間分別進行獨立樣本t檢驗，檢測均值有無顯著性差異，P<0.05為有顯著性差異。2 結果2.1 QBC939細胞中CD147 mRNA的表達 RTPCR擴增可見QBC939細胞中CD147 mRNA有表達。擴增基因片段大小為986 bp，與預期的大小相等（圖1）

13、。2.2 QBC939細胞中CD147蛋白表達 免疫熒光結果顯示，CD147是一種膜蛋白，主要表達在QBC939細胞的胞膜上，在胞漿中也有少量的表達(圖2)。2.3 反義CD147轉染QBC939細胞后CD147、MMP2和MMP9蛋白表達 運用Westernbloting檢測反義CD147轉染QBC939細胞后CD147、MMP2及MMP9蛋白表達變化見圖3。運用Mias軟件分析各條帶的積分光密度值，發(fā)現(xiàn)經(jīng)反義CD147轉染后，QBC939細胞中CD147蛋白表達與對照組及LacZ組相比較明顯下調(diào)(P<0.01)；反義CD147組MMP2蛋白表達與在對照組及LacZ組相比明顯下

14、調(diào)(P<0.01)；而MMP9無明顯變化(P>0.05)。所有對照組與LacZ組相比，CD147、MMP2和MMP9蛋白表達均無明顯變化(P>0.05)。2.4 反義CD147對腫瘤體積增長的影響 15只裸鼠接種腫瘤細胞，種植1周后計算腫瘤的體積，結果表明，三組腫瘤體積均有增長，從第2周開始，反義CD147組對比LacZ組、PBS組，腫瘤增幅明顯減少(P<0.01)；而LacZ組與對照組比較，腫瘤增幅無明顯差異(P>0.05)，說明反義CD147組的腫瘤生長受到明顯的抑制(圖4)。3 討論 CD147參與多種不同的生理過程并

15、具有多種不同的生理功能56。有研究發(fā)現(xiàn)，癌周間質細胞與癌細胞的相互作用可顯著上調(diào)MMPs在癌變組織中的分泌水平，而表達在腫瘤細胞表面的CD147分子可以對腫瘤及瘤周的MMPs有調(diào)節(jié)的作用7，CD147分子是腫瘤的浸潤和轉移的一個不可忽視的因子。 在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有CD147表達的增高，在部分腫瘤中隨著腫瘤惡性程度的增高，CD147的表達也增高。有研究表明CD147分子在轉移的腫瘤中表達更高，推測在腫瘤細胞中高表達的CD147通過刺激腫瘤周及瘤內(nèi)的成纖維細胞表達MMPs來促進腫瘤細胞的浸潤及轉移8。Zucker等將EMMPRIN(CD147)轉染人類乳腺癌細胞株MDAMB436后種植裸鼠，轉染

16、的細胞株與未轉染者相比表現(xiàn)出更強的致瘤性及浸潤性，同時發(fā)現(xiàn)它可以促進腫瘤中膠原酶MMP2及MMP9的表達增加，據(jù)此推測，CD147在腫瘤浸潤及生長中通過促進MMPs的表達而起重要作用9。MMPs在腫瘤侵襲和轉移發(fā)揮重要作用，其中最重要的是MMP2和MMP910。MMPs主要通過以下幾種機制促進腫瘤的侵襲性生長：MMPs作用使腫瘤細胞周圍的物理屏障破壞；MMPs可重塑細胞間粘附力，以便腫瘤細胞向周圍生長；MMPs通過對細胞外基質的改建，促進腫瘤新血管的形成11。同時，活化的MMPs可使其他MMPs活化，其具有相互激活的能力12。 本實驗中發(fā)現(xiàn)膽管癌細胞表達CD147分子,同時進一步通過反義CD1

17、47分子轉染人膽管癌細胞株下調(diào)腫瘤細胞的CD147分子后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中MMP2的表達量也隨之明顯下調(diào)，而MMP9卻沒有變化。這表明CD147分子的表達與膽管癌細胞中MMP2的表達密切相關，CD147分子表達的下調(diào)可使MMP2的表達明顯下降。而CD147調(diào)節(jié)MMP2的信號通路及機制有待進一步的研究。通過裸鼠荷瘤實驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)了CD147分子的膽管癌細胞在動物體內(nèi)的生長速度明顯減緩，表明CD147分子的高表達能夠促進膽管癌的腫瘤生長，并且CD147促進腫瘤生長的能力可能與MMP2的高表達密切相關?！緟⒖嘉墨I】 1 王曙光，韓本立，陳意生，等.膽管癌轉移途徑的研究J.中華外科雜志，1996，34(6

18、):352-354.2 Guo H, Li R, Zucker S, et al. EMMPRIN (CD147), an inducer of matrix metalloproteinase synthesis, also binds interstitial collagenase to the tumor cell surfaceJ. Cancer Res, 2000,60(4):888-891.3 王耀東，施作霖，邱福南，等. MMP9，IV型膠原和CD44v6在肝門部膽管癌中的表達及與預后關系的探討J.中華肝膽外科雜志，2001，7(2):115.4 楊福全，戴顯偉，趙海鷹，等.肝

19、門膽管癌基質金屬蛋白酶MMP2及其組織抑制因子TIMP2表達及意義的研究J.中國現(xiàn)代普通外科進展，2002，5(2):80-84.5 Yurchenko V, OConnor M, Dai WW, et al. CD147 is a signaling receptor for cyclophilin BJ. Biochem Biophys Res Commun, 2001,288(4):786-788.6 Pushkarsky T, Zybarth G, Dubrovsky L, et al. CD147 facilitates HIV1 infection by interacting w

20、ith virusassociated cyclophilin AJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98(11):6360-6365.7 Misra S, Ghatak S, Zoltan Jones A, et al. Regulation of multidrug resistance in cancer cells by hyaluronanJ. J Biol Chem, 2003,278(28):25285-25288.8 Kanekura T, Chen X, Kanzaki T. Basigin (CD147) is expressed on melanoma cells and induces tumor cell invasion by stimulating production of matrix metalloprotei