目前人工韌帶與組織工程韌帶的研究現(xiàn)狀

1、目前人工韌帶與組織工程韌帶的研究現(xiàn)狀         【摘要】  交叉韌帶損傷后，由于其愈合能力較差，因此長期以來，對重建交叉韌帶使用材料的研究從未停止過。本文主要對細胞因子在組織工程學韌帶中的應(yīng)用、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在組織工程韌帶研究中的應(yīng)用、組織工程韌帶附麗的基礎(chǔ)研究，骨和組織工程韌帶之間的愈合關(guān)系作了較詳細介紹。另外，對人工合成韌帶、膠原支架韌帶也作了概述。 【關(guān)鍵詞】  人工韌帶；組織工程韌帶   交叉韌帶損傷后愈合能力極差，目前臨床重建交叉韌帶使用的材料包括自體移植物、異

2、體移植物和人工合成材料。自體和異體移植物重建交叉韌帶依然是目前的主流選擇，常見的自體髕腱或半腱肌移植具有較高的強度，在附麗位點能夠獲得骨骨或腱骨愈合。但對自體供區(qū)會繼發(fā)膝前疼痛、髕腱炎、髕下脂肪墊攣縮、相應(yīng)部位髕骨骨折、繩肌缺失等并發(fā)癥。異體髕腱、跟腱、闊筋膜材料存在來源少、免疫排斥反應(yīng)、生物長入延遲甚至傳播疾病的危險12。因此，長期以來，人工韌帶的研究從未停止。而近年來，組織工程技術(shù)重建交叉韌帶的實驗也成了新的研究熱點。1  人工合成韌帶人工韌帶的研究與臨床應(yīng)用經(jīng)歷了漫長的曲折過程。人工韌帶具有無供區(qū)并發(fā)癥、使用方便、早期康復(fù)、無疾病傳播危險等許多明顯優(yōu)勢。理想的材料，應(yīng)該具備持續(xù)

3、高強度、耐磨損、無組織反應(yīng)等基本特性，并具有正常韌帶的功能，同時允許有生理排列、再生新韌帶傾向的組織逐漸長入。然而，完全符合上述條件的人工韌帶尚未面世。自上世紀60年代，人工韌帶已經(jīng)進入臨床應(yīng)用。70年代后的20年，有多種類型的人工韌帶被植入體內(nèi)。其中有許多著名的產(chǎn)品，包括GoreTex，LeedsKeio，Kennedy等。在材料選擇上，完全合成的碳纖維韌帶，因在關(guān)節(jié)和淋巴內(nèi)釋放磨損顆粒，引起顯著的炎性反應(yīng)。此后，以碳支架結(jié)合膠原或聚酯、聚四氟乙烯纖維束合成的聚合物，臨床成功率均不高。 滌綸和聚丙烯等帶孔的纖維織物， 理論上允許周圍組織遷移長入，再生具有功能的韌帶，同樣因不可吸收而引發(fā)顯著的

4、慢性炎癥反應(yīng)，引起移植物失敗和斷裂。在纖維織物上種植成纖維細胞后雖然可再植入體內(nèi)，但減少炎癥反應(yīng)的作用有限。對這些合成的永久支架組織學研究顯示類似瘢痕和肉芽腫。不是正常韌帶的有序膠原纖維。  對早期應(yīng)用人工韌帶的隨訪研究并未顯示優(yōu)良結(jié)果，主要問題是早期的組織反應(yīng)和晚期的磨損、松弛與斷裂。因此，在經(jīng)歷了20年的發(fā)展后，人工韌帶的應(yīng)用趨于沉寂。然而，近年來LARS(ligament advanced reinforcement system)聚酯韌帶的近期優(yōu)良結(jié)果受到了關(guān)節(jié)鏡與骨科運動醫(yī)學領(lǐng)域的重視。在設(shè)計上，該韌帶除了具備2 0004 000 N的抗拉強度外，其將關(guān)節(jié)內(nèi)部分以

5、多根平行纖維排列，允許扭轉(zhuǎn)和纖維長入。近期隨訪研究結(jié)果十分令人鼓舞：無明顯滑膜炎反應(yīng)，早期恢復(fù)運動，與金標準BPB的對照研究顯示了相同的療效(2年)。同時，對植入體內(nèi)韌帶進行的活檢以及體外的實驗均表明其具有較好的組織相容性且人工纖維之間有組織長入。目前，國內(nèi)也已開始使用LARS韌帶，我們建議使用者應(yīng)該明確地知道人工韌帶的優(yōu)缺點，嚴格掌握適應(yīng)證，并密切關(guān)注其遠期療效的觀察結(jié)果。   2  膠原支架韌帶   在認識到合成韌帶的持久、不降解性質(zhì)后，實驗人員開始進一步研究生物學支架，其中大多數(shù)為膠原支架。使用膠原支架的韌帶重建，已經(jīng)產(chǎn)生特定位點重新塑形

6、、在隧道附麗點成骨、韌帶樣過渡區(qū)及關(guān)節(jié)內(nèi)區(qū)域韌帶樣膠原排列的可喜效果。也有人以膠原纖維或在膠原纖維上種植成纖維細胞，試圖再生新韌帶。這些方法的主要缺陷為膠原支架是異源的，具有相似的相關(guān)并發(fā)癥。    3  組織工程韌帶   Cao等在無胸腺裸鼠皮下種植帶有小牛肌腱成纖維細胞的聚乙醇酸支架，再生的新肌腱力學特性類似于正常小牛肌腱力學特性。Ibarra等采用相似的技術(shù)，將從小牛交叉韌帶提取的成纖維細胞種植在聚乙醇酸支架上后， 再種植于裸鼠背部皮下， 幾周后再生出韌帶樣結(jié)構(gòu)。在這兩項研究中，隨時間推移，再生組織似乎獲得了與正常韌帶和肌腱類似

7、的大體和組織學特性。Ibarra將兩種不同細胞種植在聚乙醇酸上，在裸鼠模型上再生出韌帶和骨的復(fù)合結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的中央部分為韌帶樣組織，最初種植小牛骨膜細胞的兩端形成骨樣組織，并經(jīng)特定的組織學茜素紅染色證實，X線分層拍片證實有礦化。這些研究提示我們能夠以患者自身細胞和合成的生物降解聚合物支架，再生自體組織。3.1  細胞因子在組織工程學韌帶中的應(yīng)用 韌帶損傷后，存在于局部環(huán)境中的細胞因子，對于激發(fā)序列性炎癥、增生和重新塑形來說是十分重要的。以細胞因子如表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、血小板衍生生長因子(plateletderved gro

8、wth factor，PDGF)和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)處理的韌帶細胞，其增殖速度比未處理的細胞快8倍?；境衫w維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子 l(transforming growth factor 1，TGF 1)，PDGFB，EGF和胰島素樣生長因子(insulinlike growth  factor，IGF)均可促進成纖維細胞的有絲分裂。聯(lián)合使用bFGF，TGF 1，IGF，PDGFB對兔子交叉韌帶外植物生長的細胞有促進效應(yīng)。體外測定細胞因子對韌帶

9、細胞的具體作用，證實EGF誘導(dǎo)韌帶成纖維細胞的增殖，可誘導(dǎo)糖蛋白合成，但減少I型膠原的合成。IGFI可刺激細胞增殖、I型膠原合成和糖蛋白合成。對于TGF治療的老鼠內(nèi)側(cè)副韌帶，使其斷裂的力量、強度和能量均增大，TGF最有希望成為促進交叉韌帶生長的重要因子。經(jīng)細胞因子處理的韌帶細胞種植在生物降解聚合物上，可增強其增殖和基質(zhì)合成能力。最理想的可控制釋放系統(tǒng)可能是將這些細胞因子直接加入生物降解聚合物上，產(chǎn)生一定的支架，釋放韌帶特異性有絲分裂，同時提供產(chǎn)生組織工程韌帶的三維框架。   3.2  基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在組織工程韌帶研究中的應(yīng)用 韌帶和肌腱成纖維細胞易被很多病

10、毒和非病毒介質(zhì)所轉(zhuǎn)染910，在體內(nèi)實驗，標志基因已經(jīng)被直接和間接轉(zhuǎn)染到韌帶和肌腱，體外實驗轉(zhuǎn)移cDNA編碼的細胞因子如TGF1，可促進細胞分裂和胞外基質(zhì)沉積。新技術(shù)顯示在原位膠原基質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)染時，韌帶細胞持續(xù)轉(zhuǎn)基因表達，BMP12和BMP13促進間充質(zhì)干細胞分化，其表象為韌帶和肌腱。   3.3  組織工程韌帶附麗的基礎(chǔ)研究 組織工程韌帶替代物堅強固定骨上后才能發(fā)揮作用。在骨和新韌帶之間形成生物學附麗后，該韌帶才能發(fā)揮長久的替代功能。了解正常韌帶附麗點的基本結(jié)構(gòu)和功能以及軟組織和骨之間愈合的基本生物學知識，將有助于研究組織工程韌帶的附麗方法，研究出新的韌帶堅

11、強附麗技術(shù)是十分重要的。  替代韌帶可附麗到骨面或骨隧道內(nèi)。可使用阻滯螺釘11(金屬或可吸收聚合物)將韌帶固定在骨隧道內(nèi)，或者使用縫合、騎縫釘或螺釘和墊片固定在骨隧道外。           目前，對不同方法固定肌腱骨接合部的基礎(chǔ)生物學和生物力學特點還知之甚少。已經(jīng)清楚固定在骨隧道外的韌帶越長，越可能導(dǎo)致韌帶隧道間的移動，原因是韌帶所受扭轉(zhuǎn)力過高(橡皮筋效應(yīng))，這種運動及運動量對愈合的影響還不清楚。為了應(yīng)對這種運動，可直接以阻滯螺釘固定。直接以阻滯螺釘固定所造成的力學環(huán)境(螺釘擠壓)與

12、韌帶固定在隧道之外的力學環(huán)境(韌帶隧道移動造成剪切)不同。使用生物可吸收螺釘，在聚合物降解過程中，可產(chǎn)生炎性介質(zhì)，造成局部酸性環(huán)境，這些因素極可能影響局部韌帶骨愈合。雖然以螺釘將肌腱擠壓到骨上可改善愈合，但是使用阻滯螺釘也可能造成肌腱隧道的不均勻接觸，導(dǎo)致不均勻愈合。其他新固定材料(用于固定ACL)包括通過隧道的橫向針，將韌帶纏繞后箍緊，以及貼附韌帶的聚合物鎖定材料，裝進套筒后鎖進骨內(nèi)。這些材料要求輕度擴大骨隧道，造成韌帶和骨隧道的間隙過小。有關(guān)韌帶和骨隧道間的間隙小到何種程度會影響愈合以及滑液對韌帶骨界面愈合的影響還不清楚。使用這些材料時，可能發(fā)生骨隧道內(nèi)韌帶與皮質(zhì)骨或松質(zhì)骨的愈合，至今還沒

13、有韌帶與隧道內(nèi)皮質(zhì)骨還是松質(zhì)骨愈合研究的報道。  也可將組織工程韌帶固定到骨面，以縫合錨、騎縫釘、螺釘和墊片或者綜合技術(shù)12固定到骨面，通常使用縫合錨固定。雖然縫合錨的初始拉力足夠大，但是在僅次于最大循環(huán)負荷的過程中，可發(fā)生部分拉出。這種拉出導(dǎo)致韌帶骨修復(fù)位點的間隙形成。還不清楚韌帶骨修復(fù)位點間隙較小對愈合的影響以及多大間隙可能影響愈合。不同的韌帶修復(fù)到骨面技術(shù)可能導(dǎo)致韌帶和骨間接觸面大小不同，接觸面對韌帶最終的貼附力影響還不清楚。韌帶和其下方骨之間壓力大小可能會影響愈合程度及最終的貼附力。  34  骨和組織工程韌帶之間的愈合 骨長入到移植的

14、韌帶才能獲得新韌帶的堅強附麗，骨長入可能受到組織工程韌帶的生物化學和結(jié)構(gòu)特性影響。使用的聚合物類型和水解或主動降解的代謝廢物，可能影響愈合。殘留聚合物的多孔性、孔徑大小和孔的幾何形狀可能影響愈合。使用能支撐和利于骨長入的材料是十分重要的。誘導(dǎo)韌帶和其下方骨之間形成纖維軟骨區(qū)能更有效地降低軟組織和硬組織間的應(yīng)力集中。允許更早負重，ROM鍛煉，更主動地康復(fù)，更快地恢復(fù)工作或體育運動14。因為肌腱骨的愈合機制最可能涉及骨長入到肌腱和骨之間的界面，所以骨誘導(dǎo)因子可能參與啟動和調(diào)節(jié)這種骨長入，如骨形態(tài)蛋白BMP就有增強骨長入到膠原組織的能力；重組人類BMP2(recombinant human BMP2

15、，rhBMP2)也有增強肌腱在骨隧道的長入能力。組織學分析證實rhBMP2處理后，骨更早、更充分地長入到肌腱骨界面，生物力學測試證實貼附力的增加更早。BMP12可誘導(dǎo)肌腱和骨之間形成正常外形結(jié)構(gòu)的直接附麗。通過對發(fā)育中的老鼠胚胎原位雜交研究支持這些發(fā)現(xiàn)，證實BMP12轉(zhuǎn)錄mRNA到發(fā)育中的肌腱和韌帶附麗點。這些數(shù)據(jù)提示BMP12在附麗位點發(fā)育中發(fā)揮主要作用，可有效地增強韌帶骨的愈合。    另一種有利于韌帶骨愈合的細胞因子為TGF，外源的rhTGF能加速骨長入到狗模型的微孔涂層假體，當以抗TGF抗體阻止TGF的活動時，細胞遷移則被抑制，提示TGF在成纖維

16、細胞遷移進入肌腱和骨之間界面時發(fā)揮重要作用。其他細胞因子如FGF，PDGF、肝細胞生長因子都可能增強韌帶骨的愈合。綜合應(yīng)用生物降解聚合物技術(shù)、細胞因子治療、體外細胞培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染等組織工程學技術(shù)，將會有助于進一步確定韌帶修復(fù)替代的生物學基本理論，開發(fā)出一種新的韌帶替代技術(shù)?！緟⒖嘉墨I】  “ 1“ Sherman O H,Bamffy M B.Anterior cruciate ligament reconstruction：Which graft is best“J“.Arthroscopy,2006,22(9):974-980.“ 2“ Lawhorn K W,Howell S

17、M.Scientific justification and technique for anterior cruciate ligament reconstructi on using autogenous and allogenic softtissue grafts“J“.Orthop Clin North Am,2005,36:19-30.“ 3“ Durseln L,Dauner M,Hierlemann H.Resorbable polymer fibers for ligament augmentation“J“.J Biomed Mater Res,2001,58 (6):66

18、6-672.“ 4“ Cao Y,Vacanti J P,Max,et al.Generation of neotendon using synthetic polymers seeded with tenocytes“J“.Transplant Proc,2000,32:3390-3392.“ 5“ Ibarra C,Cao Y,Kin T H.Tissue engineering ligaments“J“.Surg Forum,2001,52:611-615.“ 6“ Evans C H,Ghivizzani S C,Robbins P D.Orthopaedic gene therapy

19、“J“.Clin Orthop,2004,429:316-329.“ 7“ Steinert A F,Palmer G D,Evans C H.Gene therapy in the musculosketal system“J“.Curr 0pin Orth,2006,17:318-324.“ 8“ Goidstein S A,Moalli M R,Daclam D V M.Current concepts in tissue engineering:cell,matrices,and genes“J“.Curr Opin Orth,2004,15:424-427.“ 9“ Hilderbr

20、and K A,Frank C B,Hart D A.Gene intervention in ligament and tendon:currentstatus,challenges,future direction Gene Ther,2006,13:368-378.“10“ Helm G A,Li J Z,Alden T D A.Light and eiectron microscopic study of ectopic tendon and ligament formation induced by bone morphogenetic protein13 adenoviral gene therapy“J“.J Neurosurg,2004,98(2):298-307.“11“ Kotani A,Ishii Y.Recon