夏枯草對草酸結(jié)石小鼠鈣代謝及腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響91

1、夏枯草對草酸結(jié)石小鼠鈣代謝及腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響李靜收稿日期：基金項(xiàng)目：安徽科技學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目（ZRC2013366）；安徽科技學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科基金項(xiàng)目(AKXK20101-2)作者簡介：李靜（1979），女，黑龍江省齊齊哈爾人，講師，博士。從事中草藥防治結(jié)石疾病方面的研究，TelE-mail：lijing3719。 *李靜為通訊作者。 胡國全 桂敬強(qiáng) 賀紹君 劉德義 陳會良 靳二輝（安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院 安徽省鳳陽縣東華路9號 233100）摘要：目的 探討夏枯草對草酸結(jié)石小鼠的鈣代謝及腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響。方法 用乙二醇和氯化銨誘導(dǎo)結(jié)石，用夏枯草干預(yù)，第28

2、d，測定血清中鈣和磷含量，測定肝臟、右側(cè)腎臟和腦組織勻漿中的鈣含量，左腎用于制作HE染色切片。結(jié)果 結(jié)石組腎鈣顯著高于對照組（P<0.05），而夏枯草組腎鈣顯著低于結(jié)石組（P<0.05），與對照組差異不顯著。各組的血清、肝、腦組織勻漿中鈣含量差異均不顯著。結(jié)石組的腎小管腔中分布大量散在的透明草酸鈣晶體，夏枯草組腎組織未見草酸鈣晶體沉積，且腎小管擴(kuò)張情況明顯緩解。結(jié)論 夏枯草可減少草酸結(jié)石小鼠的腎鈣含量，減緩腎小管的擴(kuò)張，保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，可做為防治草酸結(jié)石的輔助藥物。關(guān)鍵詞：夏枯草；草酸結(jié)石；腎；小鼠中圖分類號：S853.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A   文章編號：Eff

3、ect of Prunella vulgaris L. on Calcium Metabolism and Renal Structure of Calcium Oxalate Stones in MiceLI Jing* , Hu Guo-quan, Gui Jing-qiang, He Shao-jun, Liu De-yi, Chen Hui-liang Jin Er-hui(College of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang, Anhui 233100, China) Abstract

4、: Objective To investigate the intervention effect of Prunella vulgaris L. on calcium oxalate stones in mice of calcium metabolism and renal structure. Method The mice with calcium oxalate stone formation were induced by 1% ethylene glycol and 1% ammonium chloride, meanwhile used Prunella vulgaris L

5、. as intervening factors. After 28 days, the calcium and phosphorus content was measured in serum. The content of calcium in liver，right kidney and brain organization homogenate were detectedHistological section of left kidney were made HE staining. The calcium content and phosphate content in kidne

6、y tissues a was determined. Histological section of kidney were made HE staining. Results That calcium levels in renal tissue of Oxalate Calcium Stone group was significantly higher than normal control group（P<0.05）, calcium levels in renal tissue of Prunella vulgaris L. Oxalate Calcium Stone gro

7、up was significantly lower than Oxalate Calcium Stone group（P<0.05）, and than normal control group was no significant differences. The content of calcium in liver and brain organization homogenate in each groups was no significant differences. The calcium oxalate stones in renal tubular were visi

8、ble in the Oxalate Calcium Stone group, crystals deposition of calcium oxalate stones in Prunella vulgaris L. group were significantly reduced, significantly reduce renal tubular dilation. Conclusion The Prunella vulgaris L. could reduce the calcium content in renal organization homogenate, urea nit

9、rogen and creatinine content in the body, and slow the expansion of renal tubular, protection of renal tubular epithelial cell structure in mice of calcium oxalate stones, can be used as supplementary drug in preventing oxalate calcium.Keywords: Prunella vulgaris L.; calcium oxalate stones; kidney;

10、mice夏枯草（Prunella vulgaris L.）屬于唇形科夏枯草屬植物，命名取其“夏至后即枯”之意，藥用部位為干燥果穗，全草也可入藥1，主要含有三萜及其苷類、甾醇及其苷類、黃酮類、香豆素、苯丙素、有機(jī)酸、揮發(fā)油及糖類等成分2。夏枯草在調(diào)節(jié)血壓和血糖，消炎殺菌，抗病毒感染，抑制腫瘤生長方面廣泛應(yīng)用3。Utsunomiya4 等首次發(fā)現(xiàn)在體外模擬試驗(yàn)中夏枯草水提取液能有效抑制草酸鈣結(jié)晶的形成。夏枯草水提取液和甲醇提取物在體外對草酸鈣結(jié)晶形成均有抑制作用5，推測其原因可能夏枯草促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶的成核作用，但因其促進(jìn)成核和微結(jié)晶作用，故而降低了草酸鹽的飽和度，從而顯著抑制草酸鈣晶體的聚集和生長

11、6-7。草酸鈣結(jié)石屬中醫(yī)“石淋”、“砂淋”范疇8，病因是腎虛濕熱蘊(yùn)結(jié)于下焦、久之燒灼尿液中雜質(zhì)結(jié)成砂石9，夏枯草苦寒，能除濕瀉熱，疏肝解郁，同時(shí)夏枯草利尿作用明顯，提示夏枯草可能成為防治結(jié)石的輔助藥物10。本試驗(yàn)采用1%乙二醇和1%氯化銨溶液飲水誘導(dǎo)形成草酸鈣結(jié)石模型，測定小鼠血清、肝臟、腎臟、腦組織中鈣、磷的含量，探究夏枯草對草酸結(jié)石小鼠的鈣、磷代謝的影響，研究夏枯草對草酸結(jié)石小鼠腎小球和腎小管組織結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究其藥用價(jià)值和開發(fā)防治草酸結(jié)石的藥物提供試驗(yàn)依據(jù)。 1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料1.1.1 試驗(yàn)動物由安徽省試驗(yàn)動物中心提供的SPF級昆明小鼠30只，雄性，60日齡，動

12、物生產(chǎn)許可證號SCXK(皖)2011-002。試驗(yàn)鼠顆粒飼料中鈣含量1.43，磷含量0.87 。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度20 24 ，濕度50 %65 %，光照12 h13 h。1.1.2 試驗(yàn)藥品與試劑氯化銨（NH4Cl），滬試生產(chǎn)，批號：F20050621，分析純。乙二醇（C2H6O2），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號：T20110608，分析純。夏枯草，經(jīng)安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院時(shí)維靜教授鑒定為正品，安徽省福春堂中藥飲片有限公司，產(chǎn)地：湖南，批號：2011063；圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn)的生化分析試劑盒：鈣試劑盒，批號：142211014；無機(jī)磷試劑盒，批號：142411013。南

13、京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒：鈣測定試劑盒，批號：20120413；磷測定試劑盒，批號：20120418，用于測定組織蛋白的考馬斯亮藍(lán)試劑盒，20120415，乙醇、二甲苯、伊紅、蘇木精等均為國產(chǎn)級分析純。1.1.3 試驗(yàn)主要儀器設(shè)備自動煎藥包裝機(jī)，青島達(dá)爾電子機(jī)械銷售有限公司；Mindray BS200全自動血清生化分析儀；分光光度計(jì)；離心機(jī)；高壓蒸汽滅菌器；電動玻璃勻漿機(jī)；漩渦混合儀；IEICA-RM-2128型切片機(jī)，LY-1型展片機(jī)；OLYMPUS-CH30顯微攝影系統(tǒng)。1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 草酸鈣成石液的配制參考文獻(xiàn)11中的建立草酸結(jié)石模型小鼠方法配制草酸鈣成石液：配制比例為

14、：氯化銨1 g，乙二醇1 mL，用蒸餾水定容到100 mL。1.2.2夏枯草水煎液的制備將500g的夏枯草放入無紡布煎藥袋中，浸泡入5 L水中2h，自動煎藥包裝機(jī)煎煮至沸騰后文火30min，過濾；藥渣再次加入2.5L水，煎煮至沸騰后文火20min，將兩次濾液混合，濃縮至250mL，相當(dāng)于2g/mL，高壓蒸汽滅菌，4冰箱存放。1.2.3分組與采樣小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后，按體重相近原則分為對照組，結(jié)石組和夏枯草組。結(jié)石組和夏枯草組飲用草酸鈣成石液，對照組飲用蒸餾水。小鼠給藥采用灌胃方式，夏枯草組灌胃夏枯草水提取液10mLkg·d，對照組和結(jié)石組灌胃相應(yīng)體積的生理鹽水，持續(xù)28d。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)

15、，小鼠禁食不禁水過夜，稱重，雙側(cè)眼球摘除法采血，制備血清，血清中的鈣、磷含量用Mindray BS200全自動血清生化分析儀測定，處死剖殺，取肝臟，腎臟，腦組織，按公式計(jì)算腎體比，腎體比（%）=腎臟濕重（g）/宰前活重（g）×100，其中左側(cè)腎臟采用4中性甲醛固定，石蠟包埋，6m 切片，HE染色，觀察組織結(jié)構(gòu)，右側(cè)腎臟用于測定組織勻漿中的鈣、磷含量。肝臟，右側(cè)腎臟，腦組織用冰生理鹽水沖洗后制備10%的組織勻漿，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒測定鈣含量。1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析各

16、數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 試驗(yàn)結(jié)果2.1 夏枯草對草酸鈣結(jié)石小鼠體重和腎體比的影響 表1 各組小鼠腎臟指數(shù)的比較Table 1 The comparison of the mices kidney index in each group組別Group宰前體重(g)weight 腎體比（%）kidney index對照組normal control group27.78±1.73 1.12±0.09結(jié)石組Oxalate Calcium Stone group30.17±4.36 1.64±0.16*夏枯草組Prunella

17、 vulgaris L. group29.81±2.16 1.11±0.14注：與對照組比較 *表示P<0.05，*表示P<0.01；與結(jié)石組比較表示P<0.05，表示P<0.01，下同。Note: that compared with the normal control group, * P<0.05, * P<0.05, that compared with the Oxalate Calcium Stone group, P<0.05, P<0.05, the same below.由表1數(shù)據(jù)可顯示，各組小鼠的宰前體重

18、差異均不顯著，結(jié)石組的腎體比極顯著高于對照組，均數(shù)高0.52%，結(jié)石組的腎體比極顯著高于夏枯草組，均數(shù)高0.51%，而對照組和夏枯草組的腎體比差異不顯著。2.2夏枯草對草酸結(jié)石小鼠血清鈣、磷及肝、腎，腦組織鈣含量的影響表2各組小鼠血清鈣、磷及肝、腎，腦組織鈣含量的比較 Table 2 The comparison of the mices calcium and phosphorus levels in serum and calcium in liver，kidney and brain organization in each group組別Group血清Ca（mmol/L）calcium

19、血清P（mmol/L）phosphorus肝組織Ca(umol/gprot)calcium in renal tissue腎組織Ca(umol/gprot)calcium in kidney腦組織Ca(umol/gprot)calcium in brain對照組normal control group2.04±0.112.52±0.2594.48±2.8092.63±2.3346.06±3.96結(jié)石組Oxalate Calcium Stone group2.01±0.303.43±0.48*96.78±5.2810

20、3.38±3.38*47.48±1.38夏枯草組Prunella vulgaris L. group1.95±0.172.77±0.6196.82±3.6390.30±1.5446.72±4.75由表2數(shù)據(jù)顯示，各組小鼠血清鈣含量差異均不顯著，結(jié)石組小鼠血清磷含量顯著高于對照組和夏枯草組（P <0.05），對照組和夏枯草組的血清磷含量差異不顯著，結(jié)石組小鼠腎組織中鈣含量顯著高于對照組和夏枯草組(P<0.05)，對照組和夏枯草組的腎組織中鈣含量差異不顯著，各組肝組織、腦組織中的鈣含量各組差異均不顯著。2.3夏枯草對

21、尿酸結(jié)石小鼠腎組織結(jié)構(gòu)的影響DtPtRcRc圖1 對照組腎臟皮質(zhì)（HE，400×） 圖2 對照組腎臟髓質(zhì)（HE，400×）Fig. 1 Kidney cortex in normal control group Fig. 2 Kidney medulla in normal control groupDtPtRc 圖3 結(jié)石組腎臟皮質(zhì)（HE，400×） 圖4 結(jié)石組腎臟髓質(zhì)（HE，400×）Fig. 3 Kidney cortex in Oxalate Calcium Stone group Fig. 4 Kidney medulla in Oxalat

22、e Calcium Stone groupDtPtRcRcRc 圖5 夏枯草組腎臟皮質(zhì)（HE，400×） 圖6 夏枯草組腎臟髓質(zhì)（HE，400×）Fig. 6 Kidney medulla in Prunella vulgaris L. intervention groupFig. 5 Kidney cortex in Prunella vulgaris L. intervention group注：Rc 腎小球； Pt 近曲小管；Dt 遠(yuǎn)曲小管Note: Rc Renal corpuscle; Pt Proximal convoluted tubule; Dt Dista

23、l convoluted tubule;草酸鈣結(jié)晶在常規(guī) HE 病理切片下為無色透明晶體，由圖1可見正常組小鼠腎小體斷面接近圓形，毛細(xì)血管球位于腎小體中央且結(jié)構(gòu)完好，腎小囊壁層和臟層細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，腎小囊的結(jié)構(gòu)和體積大小正常，腎小管排列緊密，近端、遠(yuǎn)端腎小管組織結(jié)構(gòu)清晰且管腔大小正常，近曲小管管徑較粗，管腔較小，遠(yuǎn)曲小管管徑較細(xì)，管腔較大，腔面規(guī)則，細(xì)胞排列緊密，對照組大鼠未見腎小管擴(kuò)張和草酸鈣晶體沉積，無病理變化，圖2可見腎臟髓質(zhì)內(nèi)遠(yuǎn)端腎小管和集合管管壁上皮細(xì)胞排列整齊，管腔大小正常，細(xì)胞界限明顯。圖3中結(jié)石組小鼠腎小球體積和囊腔大小正常，皮質(zhì)部腎組織腫脹，近端腎小管的管壁腫脹變厚，管腔大小未

24、見明顯變化，遠(yuǎn)端腎小管管壁輕微變薄且管腔擴(kuò)張，明顯變大，圖4中結(jié)石組部分髓質(zhì)內(nèi)遠(yuǎn)端腎小管和集合管管壁變薄且模糊，細(xì)胞數(shù)量減少，界線不清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞壞死、脫落、變性，細(xì)胞核大部分降解，胞漿減少，排列不整齊，腎小管腔顯著變大粗，異常擴(kuò)張，管壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，變性、壞死，腎小管腔內(nèi)有的大量彌漫散布的透明結(jié)晶體，部分結(jié)晶體形成較大的不規(guī)則四邊形或六邊形或連成片狀，部分腎小管的管腔內(nèi)可見嗜伊紅樣染色壞死物質(zhì)及部分, 腎間質(zhì)有明顯慢性炎性細(xì)胞浸潤，圖5可見夏枯草組腎小球的輕度萎縮，腎小囊腔變大，腎小囊壁層和臟層細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，近端腎小管的管壁腫脹輕度腫脹且管腔縮小，遠(yuǎn)端腎小管管壁變薄且管腔變大

25、，圖6顯示夏枯草組腎髓質(zhì)內(nèi)遠(yuǎn)端腎小管和集合小管未見異常擴(kuò)張，但部分腎小管管壁變薄，上皮細(xì)胞界限較為清晰，部分腎小管管腔中有紅色絲狀物質(zhì)滲出，未見結(jié)晶體，髓袢細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。3 討論乙二醇是草酸的前體物質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為草酸，從腎臟分泌排泄，氯化銨可酸化尿液，具有腎毒作用，可損害腎小管，二者協(xié)同，可形成泌尿系統(tǒng)的草酸鈣結(jié)晶12。采用乙二醇配合不同藥物或試劑作誘石劑誘發(fā)大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型，可以篩選、評價(jià)防治結(jié)石藥物療效13。本試驗(yàn)中結(jié)石組的腎體比極顯著高于對照組和夏枯草組，可能草酸結(jié)石小鼠在氯化銨和乙二醇的刺激作用下，腎臟中草酸鈣結(jié)晶沉積及繼發(fā)的機(jī)械性、阻塞性炎癥使腎臟腫脹增重。夏枯草組與對照組

26、腎體比接近，說明夏枯草可能在減少腎臟中草酸鈣結(jié)晶及緩解腎臟炎癥方面發(fā)揮一定的作用。機(jī)體內(nèi)鈣的代謝異常是引起含鈣尿路結(jié)石的重要因素之一。泌尿系結(jié)石產(chǎn)生是由于體內(nèi)促進(jìn)結(jié)石和抑制結(jié)石的條件失衡所致，其成分以草酸鈣結(jié)晶居多14-15，其形成與體內(nèi)鈣代謝和沉積及草酸代謝有關(guān)。草酸鈣結(jié)石的形成與高鈣尿有關(guān)，腎臟遠(yuǎn)曲小管和集合管的上皮細(xì)胞受損導(dǎo)致鈣的重吸收障礙，也可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的粘附性增加16。肖勁逐17等研究表明，飲用 1%乙二醇+ 3%NH4Cl 3.0 mL 每天分兩次灌胃Wistar 健康雄性大鼠，連續(xù)4 w給予一定劑量的夏枯草不同提取物干預(yù)，結(jié)果顯示各組鈣磷無差異，夏枯草水溶和夏枯草50%甲

27、醇組腎鈣明顯低于草酸鈣結(jié)石模型大鼠結(jié)石組。本研究的結(jié)果表明各組血清鈣差異不顯著。結(jié)石組的腎組織鈣濃度明顯高于正常組和夏枯草組，差異有顯著性意義，可能由于腎組織中形成大量草酸結(jié)晶有關(guān)。在夏枯草干預(yù)下，能夠明顯降低造模后雄性小鼠血鈣和腎組織鈣的濃度，結(jié)石組血磷升高，可能是機(jī)體為了保證血鈣和血磷代謝的平衡，反饋地增強(qiáng)了腸道對磷吸收的結(jié)果。各組肝組織、腦組織的鈣含量差異均不顯著，說明尿道結(jié)石主要影響腎鈣的含量，而不影響其他臟器組織中鈣的含量影響。鈣磷代謝受動物品系、試驗(yàn)條件等多種因素影響，夏枯草與鈣代謝的關(guān)系需要進(jìn)一步的驗(yàn)證和研究。乙二醇和氯化銨是制備草酸鈣結(jié)石模型常用藥物，1%氯化銨和1%乙二醇溶液

28、給予小鼠自由飲用，可誘導(dǎo)形成草酸結(jié)石，本試驗(yàn)第28d，結(jié)石組的腎小管中可見大量的草酸結(jié)晶，腎小管擴(kuò)張，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致18。腎組織內(nèi)的晶體沉積受到肝臟將乙二醇等草酸前體轉(zhuǎn)變?yōu)椴菟岬乃俣纫约澳蜮}和草酸的排泄等因素影響。從本試驗(yàn)可見夏枯草減少草酸結(jié)石小鼠腎組織中的結(jié)晶，并有效緩解腎小管和集合管的擴(kuò)張，減少腎小管上皮細(xì)胞的損傷，提示夏枯草可能存在抑制尿草酸鈣結(jié)晶形成物質(zhì)，通過減少結(jié)晶保護(hù)腎臟，減少對腎小管的組織結(jié)構(gòu)的損傷。腎臟受損與草酸鈣晶體沉積相關(guān)，夏枯草可能通過吸附于草酸鈣晶體表面的能力增強(qiáng)，抑制草酸鈣結(jié)晶聚集和生長，以減緩腎小管細(xì)胞損傷。體外模擬環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境存在溫度、pH值等多種因素差異，體外

29、試驗(yàn)證明，0.25mL夏枯草水提液對10mL人工尿液中的一水草酸鈣結(jié)晶的抑制指數(shù)隨NaCl濃度和pH值升高逐漸降低19。體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)，抗草酸結(jié)石作用機(jī)理和途徑可能不同，雖然體外試驗(yàn)中夏枯草可顯著抑制草酸結(jié)晶的形成，提示夏枯草中可能存在抑制尿草酸鈣結(jié)晶形成物質(zhì)，但其抗草酸結(jié)石的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。4 結(jié)論 夏枯草水煎煮液能夠降低草酸結(jié)石小鼠腎組織中的鈣含量，但對血清、肝、腦組織勻漿中鈣含量均無顯著差異，夏枯草能夠減少腎小管內(nèi)草酸鈣結(jié)晶的大小和數(shù)量，減緩草酸結(jié)石小鼠腎小管的擴(kuò)張程度，可保護(hù)腎臟的組織結(jié)構(gòu)，在防治草酸鈣結(jié)石中發(fā)揮一定的作用。參考文獻(xiàn)1 劉悅,宋少江,徐綏緒.夏枯草的化學(xué)成

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