小黑豆乳清蛋白和多肽的提取及其功能性研究

1、小黑豆乳清蛋白和多肽的提取及其功能性研究【摘要】：本文以小黑豆為原料得到的小黑豆乳清水。經(jīng)膜技術(shù)分離 純化后得到小黑豆乳清蛋白。利用單酶水解和雙酶復(fù)合酶解法制備小 分子乳清多肽，通過體外抗 S180 和 H22 腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)篩選出抗腫瘤效 果好的多肽。對(duì)該多肽和蛋白的體內(nèi)免疫功能、抗S180 腫瘤、抗皮膚乳頭瘤和抗化學(xué)性肝癌進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明：1、試驗(yàn)用絮凝離心法對(duì)小黑豆乳清水進(jìn)行預(yù)處理，最佳工藝條件為： pH8.0、 CaCI2 加入量 15ml -1、溫度 40C。再經(jīng)微濾、超濾得到小黑豆乳清蛋白。 經(jīng)SephadexG-50 凝膠分析表明，本工藝制得的小黑豆乳清蛋白分子量 范圍在

2、6.0KD-10.0KD 的占到 50.3%,高于 10.0KD 的大分子約占 45%。 2小黑豆與黃大豆乳清水和蛋白組成的比較分析表明，小黑豆乳清水中的乳清蛋白、灰分、總糖含量均高于大豆乳清水；通過電泳分析表 明，小黑豆乳清蛋白和大豆乳清蛋白的分子量主要分布在30.0KD 以下,小黑豆乳清蛋白中的 BBI 含量高于大豆乳清蛋白。3、以小黑豆乳 清蛋白為底物，用單一蛋白酶和雙酶復(fù)合酶解制備小黑豆乳清多肽。細(xì)菌酸性蛋白酶單酶水解制備的多肽得率最高，可達(dá) 97%。雙酶復(fù)合 水解多肽得率最高的為先胃蛋白酶處理后細(xì)菌酸性蛋白酶處理，其多肽得率為 63.36%。 經(jīng) SephadexG-25 凝膠層析分

3、析表明，本工藝所得乳 清多肽的主要成分是小于 1KD 的多肽，占 80%以上。4、本研究對(duì)多 種多肽進(jìn)行體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，得到以下結(jié)論：木瓜蛋白酶水解制備的 多肽對(duì)S180 H22 腫瘤細(xì)胞的抑制效果最顯著。針對(duì)這一最佳抗腫瘤效果，設(shè)計(jì)了木瓜蛋白酶水解制備多肽的正交試驗(yàn)，得到最佳多肽制備工藝為：加酶量 5000U/g 蛋白,pH6.0 處理溫度為 65C。5、本研究 對(duì)小黑豆乳清蛋白及多肽進(jìn)行免疫功能試驗(yàn)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小黑豆乳清蛋白及多肽對(duì)小鼠免疫器官無明顯抑制作用。在相同劑量時(shí)，75C處理組抑制荷瘤小鼠各項(xiàng)免疫功能下降的作用明顯好于65C處理,且呈一定的量效關(guān)系；多肽組提高免疫效果優(yōu)于蛋白組，但

4、多肽劑量與抗 腫瘤效果呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。6、用乳清蛋白及多肽飼喂小鼠，進(jìn)行抗 S180 抗皮膚乳頭瘤和抗肝癌前期病變實(shí)驗(yàn)?？?S180 結(jié)果顯示,75C蛋白高劑量組抗腫瘤的效果優(yōu)于 65C蛋白組，抑瘤率達(dá) 41.8%。蛋白和多肽 高劑量組的抑皮膚乳頭瘤效果較好，抑瘤效果與蛋白或多肽的濃度呈 正相關(guān)?？垢伟┑慕Y(jié)果顯示，ProteAX 多肽組抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的效果 優(yōu)于木瓜多肽組，抑癌效果與多肽濃度呈正相關(guān)。小黑豆乳清蛋白及 多肽均有預(yù)防腫瘤的作用?！娟P(guān)鍵詞】：小黑豆乳清蛋白蛋白酶水解小 黑豆乳清多肽抗腫瘤功能【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)【學(xué)位級(jí)別】：碩士【學(xué)位授予年份】：2013【分類號(hào)】：TS201

5、.2【目錄】：中文摘要 11-13ABSTRACT13-15 第一章緒論 15-231.1 小黑豆及乳清蛋白的概述 15-171.1.1小黑豆的資源及分布 151.1.2小黑豆 與常規(guī)大豆乳清水中的營(yíng)養(yǎng)成分及利用情況15-161.1.3 豆乳清蛋白的主要組成及性質(zhì) 16-171.2豆乳清蛋白的研究現(xiàn)狀 17-19121乳清蛋白 的組成及研究現(xiàn)狀17-191.2.2 豆乳清蛋白的提取方法研究現(xiàn)狀191.2.3 小黑豆乳清蛋白的加工利用及功能性研究現(xiàn)狀191.3 多肽抗腫瘤的研究進(jìn)展 19-201.4 本論文的研究意義及主要內(nèi)容 20-231.4.1 研究 意義 201.4.2 研究?jī)?nèi)容 20-2

6、3 第二章小黑豆中乳清蛋白的提取及分析23-332.1 前言 232.2 試驗(yàn)材料與儀器 232.2.1 試驗(yàn)材料與試劑 232.2.2 試驗(yàn)儀器 232.3 試驗(yàn)方法 23-272.3.1 小黑豆和黃大豆乳清水中部分營(yíng) 養(yǎng)成分的測(cè)定方法 23-242.3.2 小黑豆與黃大豆乳清蛋白的提取工藝路 線242.3.3 小黑豆中球蛋白與清蛋白的分離方法242.3.4 小黑豆乳清水的加工處理方法24-252.3.5 小黑豆與黃大豆乳清蛋白組成分析25-272.4 結(jié)果與討論 27-312.4.1 黃大豆與小黑豆乳清水中部分營(yíng)養(yǎng)成 分的比較分析 272.4.2 乳清水絮凝離心預(yù)處理的最佳條件27-282

7、.4.3加工預(yù)處理過程對(duì)乳清水中乳清蛋白含量及幾種營(yíng)養(yǎng)成分的影響28-292.4.4 小黑豆與黃大豆乳清蛋白分子量分析結(jié)果29-312.5 本章小結(jié) 31-33第三章功能性小黑豆乳清多肽的制備及體外抗腫瘤研究 33-513.1前言 333.2 試驗(yàn)材料與儀器 333.2.1 試驗(yàn)材料 333.2.2 試驗(yàn)儀 器 333.3 試驗(yàn)方法 33-373.3.1 功能性乳清多肽所用蛋白酶的篩選方法 33-343.3.2 多肽含量、氨基酸態(tài)氮的測(cè)定方法34-353.3.3 多肽分子量的凝膠層析分析方法 353.3.4酶解最佳工藝條件的研究 35-363.3.5體 外抑制 S_(180)腫瘤、H_(22)

8、腫瘤生長(zhǎng)的研究方法 36-373.4 結(jié)果與討論 37-49341 不同蛋白酶制備的多肽化學(xué)指標(biāo)及分子量分析結(jié)果 37-39342木瓜蛋白酶最佳水解條件的確定 39-413.4.3 胃蛋白酶與細(xì) 菌酸性蛋白酶雙酶水解正交試驗(yàn)分析結(jié)果41-443.4.4 不同酶解多肽抑制 S_(180)腫瘤生長(zhǎng)的結(jié)果 44-46345 不同酶解多肽抑制 H_(22)腫瘤 生長(zhǎng)的結(jié)果 46-493.5 本章小結(jié) 49-51 第四章小黑豆乳清蛋白及多肽的 免疫實(shí)驗(yàn)研究 51-564.1 概述 514.2 試驗(yàn)材料與儀器 514.3 試驗(yàn)方法 51-534.3.1動(dòng)物分組和造型 51-524.3.2免疫器官指數(shù)的測(cè)定

9、 524.3.3非 特異性免疫指標(biāo)-白細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定 524.3.4 細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)-遲發(fā)型變 態(tài)反應(yīng) 52-534.3.5體液免疫實(shí)驗(yàn)-雞紅細(xì)胞做免疫原的血清溶血素測(cè) 定法 534.3.6 統(tǒng)計(jì)分析534.4 結(jié)果與討論 53-554.4.1 小黑豆乳清蛋白及 多肽對(duì)小鼠免疫器官及胰臟的影響 53-544.4.2 小黑豆乳清蛋白及多肽 對(duì)小鼠非特異性免疫及特異性免疫的影響54-554.5 本章小結(jié) 55-56 第五章小黑豆乳清蛋白及多肽的小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究56-675.1 概述565.2 試驗(yàn)材料與儀器 56-575.2.1 主要試劑與材料 56-575.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物及腫瘤細(xì)胞株 575.3 研究方法 57-605.3.1 小黑豆乳清蛋白抗 S_(180) 腫瘤的研究方法 57-585.3.2 黑豆乳清蛋白及多肽預(yù)防皮膚乳頭瘤的研 究方法58-595.3.3 小黑豆乳清多肽對(duì)化學(xué)致肝癌前期病變的預(yù)防研究 59-605.4結(jié)果與討論 60-665.4.1 小黑豆乳清蛋白抗 S_(180)腫瘤