褪黑素對(duì)睡眠的調(diào)節(jié)作用及與腦內(nèi)氨基酸遞質(zhì)的關(guān)系

1、    褪黑素對(duì)睡眠的調(diào)節(jié)作用及與腦內(nèi)氨基酸遞質(zhì)的關(guān)系        摘要目的：研究褪黑素促眠、晝夜節(jié)律作用及其與腦內(nèi)氨基酸遞質(zhì)的關(guān)系。方法：以翻正反射為指標(biāo)研究褪黑素對(duì)小鼠睡眠及其晝夜節(jié)律的影響。采用紙電泳-雙波長(zhǎng)掃描法，測(cè)定褪黑素對(duì)小鼠不同腦區(qū)中-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)含量的影響。結(jié)果：褪黑素能明顯促進(jìn)小鼠睡眠，其藥效強(qiáng)度依賴于給藥的時(shí)辰。褪黑素可使小鼠下丘腦內(nèi)-氨基丁酸含量明顯升高。但對(duì)谷氨酸水平無明顯影響。結(jié)論：褪黑素促眠作用可能與小鼠下丘腦中-氨基丁

2、酸含量升高有關(guān)。關(guān)鍵詞褪黑素；睡眠；晝夜節(jié)律；-氨基丁酸；谷氨酸The effects of melatonin on sleep and its relationship with amino acid neurotransmitters in brain in miceWang Fang(Wang F),Li Jingcai(Li JC),Xu Feng(Xu F),et al(Shenyang Pharmaceutical University Chronobiology Laboratory,Shenyang 110016)ABSTRACTOBJECTIVE：To study the

3、effects of melatonin(MT) on sleep and amino acid neurotransmitters in brain.METHODS:To determine the sleep time and circadian sleep rhythm by observing the loss of the righting reflex method in mice.The concentration of amino acid neurotransmitters(GABA,Glu) in brain was determined by the paper elec

4、trophoretic and dual wavelength thin layer scanning method.RESULTS:Melatonin could significantly prolong sleep time induced by sodium pentobarbital and markedly elevate the level of GABA but not of Glu in hypothalamus.CONCLUSION:It supposed that the effect of melatonin on sleep might be related to e

5、levated level of GABA which is one of its mechanisms in mice.KEY WORDSmelatonin,sleep,circadian rhythm,GABA,glutamic acid褪黑素(melatonin,MT)主要由松果腺分泌，具有多種生物活性。自其人工合成并作為保健食品上市以來，國(guó)內(nèi)外掀起褪黑素研究熱潮。在褪黑素諸多功能中，其誘導(dǎo)自然生理性睡眠，矯正紊亂的睡眠-覺醒節(jié)律的作用尤為引人注目。但也有些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)某時(shí)間點(diǎn)或某種實(shí)驗(yàn)條件下，褪黑素并未起到促眠作用，人們對(duì)褪黑素是否具有直接促眠作用仍存在爭(zhēng)議。目前關(guān)于褪黑素通過何種途徑來調(diào)

6、節(jié)睡眠尚不甚清楚。本文通過褪黑素誘導(dǎo)睡眠的晝夜節(jié)律性及褪黑素與不同腦區(qū)中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的關(guān)系來探討其促眠作用。1材料與方法1.1藥品與儀器褪黑素(江蘇常州醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)公司，純度99.5%),戊巴比妥鈉(上海行知化工廠),-氨基丁酸(上海試劑三廠),L-谷氨酸(上?？颠_(dá)氨基酸廠),DYY-3型電泳儀(北京六一儀器廠),CS-910雙波長(zhǎng)薄層掃描儀(日本島津制作所)。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種雄性小鼠,1822g(沈陽(yáng)藥科大學(xué)動(dòng)物室，動(dòng)物合格證號(hào)：遼實(shí)動(dòng)字第003號(hào))。1.3統(tǒng)計(jì)處理各組計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，各組質(zhì)反應(yīng)采用2檢驗(yàn)顯著性。1.4褪

7、黑素對(duì)戊巴比妥鈉閾下催眠劑量的影響小鼠po褪黑素30min后，再ip戊巴比妥鈉25mg/kg,以翻正反射消失為指標(biāo),15min內(nèi)翻正反射消失達(dá)1min以上的小鼠為發(fā)生睡眠的小鼠。同時(shí)做溶媒對(duì)照。實(shí)驗(yàn)在安靜、室溫25左右進(jìn)行，于08:00開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.5褪黑素延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間小鼠po褪黑素30min后，再ip戊巴比妥鈉40mg/kg。以翻正反射消失到恢復(fù)之間的時(shí)間為睡眠期。同時(shí)做溶媒對(duì)照。實(shí)驗(yàn)在安靜、室溫25左右進(jìn)行，于08:00開始實(shí)驗(yàn)。1.6褪黑素對(duì)小鼠睡眠晝夜節(jié)律的影響于08:00,12:00,16:00,20:00,00:00,04:00六個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別觀察褪黑素延長(zhǎng)小鼠戊巴比

8、妥鈉睡眠時(shí)間的變化，實(shí)驗(yàn)方法同1.5。1.7褪黑素對(duì)小鼠不同腦區(qū)-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)的影響小鼠ip褪黑素30min后，斷頭處死，迅速取出下丘腦、大腦皮層或腦干。用三氯乙酸制成10%的勻漿,3000r/min離心10min，取上清液，加入正丁醇-石油醚振蕩，靜置數(shù)分鐘，在層析紙上點(diǎn)樣，然后在吡啶-醋酸-水電泳液中電泳30min。茚三酮-丙酮顯色后，用雙波長(zhǎng)薄層掃描儀在510/700nm處掃描，與同時(shí)點(diǎn)樣的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，計(jì)算每克腦組織中GABA和Glu含量。于08:00開始實(shí)驗(yàn)。2結(jié)果2.1褪黑素對(duì)戊巴比妥鈉閾下催眠劑量的影響小鼠隨機(jī)分為4組，戊巴比妥鈉閾下催眠劑量為25mg/k

9、g。由表1可見,po褪黑素120mg/kg可明顯增加小鼠入睡只數(shù)，對(duì)戊巴比妥鈉閾下催眠劑量有協(xié)同作用。表1褪黑素對(duì)戊巴比妥鈉閾下催眠劑量的影響/n=10組別劑量/mgkg-1入睡只數(shù)對(duì)照組-0安定58*1MT600MT1205*2注：與對(duì)照組比較,*1P0.01;*2P0.05 2.2褪黑素延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間小鼠隨機(jī)分為4組。戊巴比妥鈉劑量為40mg/kg。由表2可見,po褪黑素30和15mg/kg均可顯著延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間。表2褪黑素對(duì)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響/±s,n=1012組別劑量/mgkg-1睡眠時(shí)間/min對(duì)照組-安定5*1MT30*1MT15*2注：與對(duì)照組比較

10、,*1P0.01;*2P0.05 2.3褪黑素對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠晝夜節(jié)律的影響由1可見，對(duì)照組戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間呈現(xiàn)節(jié)律性變化，峰值出現(xiàn)在12:00時(shí)，谷值在20:00時(shí)。施用褪黑素15mg/kg后可延長(zhǎng)戊巴比妥鈉的睡眠時(shí)間，但延長(zhǎng)的程度依賴于給藥時(shí)間，可見節(jié)律位相提前，峰值出現(xiàn)在08:00,谷值出現(xiàn)在16:00。褪黑素延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的作用因晝夜時(shí)辰而異。1褪黑素對(duì)小鼠睡眠晝夜節(jié)律的影響注：1-對(duì)照組；2-褪黑素；與對(duì)照組比較,*1P0.05;*2P0.01(n=10)2.4褪黑素對(duì)小鼠下丘腦、大腦皮層、腦干GABA含量的影響小鼠隨機(jī)分為3組。由表3可見，褪黑素15mg/kg能明顯升

11、高下丘腦中GABA的含量，但對(duì)其它腦區(qū)GABA含量的升高無明顯影響。表3褪黑素對(duì)不同腦區(qū)-氨基丁酸含量的影響/±s,n=68組別劑量/mgkg-1下丘腦/molg-1大腦皮層/molg-1腦干/molg-1對(duì)照組-MT15*MT5注：與對(duì)照組比較，*P0.05 2.5褪黑素對(duì)小鼠下丘腦、大腦皮層、腦干Glu含量的影響小鼠隨機(jī)分為3組。由表4可見，褪黑素15或5mg/kg對(duì)小鼠各腦區(qū)Glu含量無明顯影響。表4褪黑素對(duì)不同腦區(qū)谷氨酸含量的影響/±s,n=68組別劑量/mgkg-1下丘腦/molg-1大腦皮層/molg-1腦干/molg-1對(duì)照組-MT15MT53討論 內(nèi)源性褪黑

12、素具有獨(dú)特的夜高晝低的合成與分泌節(jié)律，這種生理性節(jié)律受光周期控制，由于褪黑素午夜分泌最多，亦稱為“暗激素”1,它在調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律如睡眠-覺醒方面起著重要的作用2。有些學(xué)者認(rèn)為，褪黑素主要作用是調(diào)定睡眠發(fā)生的時(shí)間，糾正紊亂的睡眠-覺醒節(jié)律，而無直接催眠作用3。本實(shí)驗(yàn)采用延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的方法來觀察褪黑素對(duì)睡眠的影響，每次實(shí)驗(yàn)均采用專人觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單次給予褪黑素能提高戊巴比妥鈉閾下催眠劑量小鼠入睡的只數(shù)，延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間，可見，單次給予褪黑素具有直接的催眠作用。多年來大多數(shù)動(dòng)物及人體實(shí)驗(yàn)肯定了褪黑素對(duì)睡眠的調(diào)節(jié)作用，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不一致，如James等(1987年)于夜間23:00給健康

13、成人口服褪黑素1,5mg/kg時(shí)，未發(fā)現(xiàn)褪黑素的催眠作用。本文通過褪黑素對(duì)延長(zhǎng)小鼠睡眠的晝夜節(jié)律性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，褪黑素延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性，褪黑素在不同時(shí)間點(diǎn)催眠效果有所不同，曲線峰值在08:00,谷值在16:00,分別為小鼠靜息相開始和后期。提示MT催眠作用具有晝夜時(shí)間依賴性。因此，在臨床應(yīng)用MT時(shí)應(yīng)注意MT的時(shí)間藥理特性，以發(fā)揮最佳效果。目前，對(duì)于褪黑素通過何種途徑調(diào)節(jié)睡眠所知甚少。已發(fā)現(xiàn)，褪黑素的許多中樞作用，如鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗焦慮等均與GABA能神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)4。GABA是廣泛存在于哺乳類動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。側(cè)腦室注射-氨基丁酸可使貓睡眠時(shí)間延長(zhǎng)

14、5，給視葉前區(qū)損傷或其它失眠模型的貓注射GABA擬似劑時(shí)，可使貓恢復(fù)睡眠6。另外，應(yīng)用微透析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在睡眠時(shí)下丘腦后部GABA濃度升高6。這些實(shí)驗(yàn)可說明腦內(nèi)，特別是下丘腦中GABA參與睡眠-覺醒過程的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，催眠劑量的褪黑素能使下丘腦GABA含量升高，說明褪黑素的睡眠調(diào)節(jié)作用與下丘腦GABA含量有關(guān)。參與GABA合成的酶是谷氨酸脫羧酶(GAD)，GAD在神經(jīng)系統(tǒng)中的分布與GABA水平相平行，并且，GAD活性強(qiáng)的部位GABA含量也高，GABA依賴于GAD來維持在神經(jīng)系統(tǒng)中的穩(wěn)態(tài)水平。褪黑素是否通過增強(qiáng)GAD活力，增加GABA含量來調(diào)節(jié)睡眠?值得進(jìn)一步證實(shí)。王芳(沈陽(yáng)藥科大學(xué)時(shí)間生物學(xué)

15、室沈陽(yáng) 110016)李經(jīng)才(沈陽(yáng)藥科大學(xué)時(shí)間生物學(xué)室沈陽(yáng) 110016)徐峰(沈陽(yáng)藥科大學(xué)時(shí)間生物學(xué)室沈陽(yáng) 110016)何瑜(沈陽(yáng)藥科大學(xué)時(shí)間生物學(xué)室沈陽(yáng) 110016)唐超(沈陽(yáng)藥科大學(xué)時(shí)間生物學(xué)室沈陽(yáng) 110016)參考文獻(xiàn)1，Li JC,Xu F.Influence of light-dark shifting on the immune system,tumor growth and life span of rats,mice and fruit flies as well as on the counteraction of melatonin.Biol Signals,1997,6(2)77.2，汪曉飛，劉志民，彭樹勛.褪黑素：一個(gè)多功能的光周期信號(hào).生理科學(xué)進(jìn)展，1998，29(3)281.3，Tzischinsky O,Lavie P.Melatonin possesses time-dependent hypotic effects.Sleep,1994,17638.4，Golombek DA,Pevet P,Cardinali DP.Melatonin effects on behavior:Possible mediation by the central GAB