乙型肝炎核酸疫苗NV-HBs肌注小鼠后HBsAg的表達和抗-HBs的誘生及局部病理觀察

1、    乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s肌注小鼠后HBsAg的 表達和抗-HBs的誘生及局部病理觀察        【摘要】目的研究乙型肝炎核酸疫苗肌注小鼠后在體內(nèi)的表達及小鼠體液免疫應(yīng)答的規(guī)律，同時觀察接種局部組織的病理變化。方法以乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s肌注小鼠，然后定期分批處死，采集肌注局部組織檢測HBsAg(ABC免疫組化法)，采集外周血標本檢測HBsAg和抗-HBs(ELISA法),并常規(guī)病理檢查。結(jié)果接種乙型肝炎核酸疫苗后1周，HBsAg的表達即可在

2、部分受檢小鼠的肌注局部組織內(nèi)檢出；接種后2周，全部受檢小鼠的肌注局部組織HBsAg檢測均呈陽性，部分受檢小鼠的外周血抗-HBs亦陽轉(zhuǎn)，此后檢出率進一步增高。接種后1個月，受檢小鼠抗-HBs即全部陽轉(zhuǎn)并持續(xù)到接種后半年以上；同期間內(nèi)，至少75%的受檢小鼠其肌注部位組織仍保持HBsAg檢出陽性，而其外周血標本內(nèi)的HBsAg檢測則始終呈陰性。病理檢查提示：核酸疫苗接種后，僅在肌注局部出現(xiàn)一過性非特異性炎癥反應(yīng)。結(jié)論乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s肌注接種小鼠后，可通過在注射部位組織中表達HBsAg，在其體內(nèi)誘生特異性抗-HBs?！局黝}詞】DNA疫苗肝炎，乙型乙型肝炎病毒表面抗原抗體HBsAg expr

3、ession, anti-HBs induction and pathological observation in the mice inoculated with DNA vaccine against Hepatitis BZHAO Liansan, QIN Shan, TANG Hong, et al. Sichuan Provincial Key Laloratory of Mdecular Biology of Infectious Diseases, First Affiliatod Hospital of Xuasi Medical University, Chengdu 61

4、0041【Abstract】ObjectiveTo study if special humoral immunological response can be induced by DNA vaccine against Hepatitis B (NV-HB/s) and its mechanism.MedthodsThe Balb/C mice inoculated with NV-HB/s by intramuscular injection were detected for HBsAg(the expressed product of NV-HB/s)by ABC immunohis

5、tochemistry or ELISA, and for anti-HBs by ELISA and also performed the routine pathological examination. ResultsAfter inoculated with NV-HB/s, HBsAg could be detected from mice muscle tissue samples of injected sites one week later and almost kept positive(75% and even more) up to 6th month, but was

6、 undetectable from all the serum samples during this period; anti-HBs could be detected from serum samples of some mice two weeks later and of all the mice detected one month later, it still kept positive at 6th month while the mice were sacrificed. Under microscope, only non-specific inflammation w

7、as found in the muscle tissues of injected sites and could completely recover within 4 weeks, no matter whether the mice were inoculated with NV-HBs, or with traditional HB vaccine derived from blood, or even with PBS as control.ConclusionDNA vaccine against Hepatitis B (NV-HB/s) can successfully ex

8、press HBsAg in the muscle tissue of mice by intramuscular inoculation and subseguently induce anti-HBs in viro.【key words】DNA vaccineHepatitis BHBsAgAntibody乙型肝炎病毒(HBV)感染可導(dǎo)致肝硬化、甚至肝癌，危害十分嚴重。目前尚無滿意的抗病毒治療手段。作者等曾報告用乙型肝炎核酸疫苗NV-HBs免疫小鼠，誘導(dǎo)出了特異性體液免疫應(yīng)答，使小鼠外周血抗HBs陽轉(zhuǎn)1。為了探討核酸疫苗的作用機理，我們進一步研究了肌注乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s在小鼠

9、體內(nèi)表達HBsAg的規(guī)律及NV-HB/s肌注部位的病理變化特點。1材料和方法1.1乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s的制備將乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)主蛋白編碼基因S插入真核細胞表達質(zhì)粒pRc/CMV/ATG中的CMV啟動子下游，以此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細胞，可高效表達HBsAg主蛋白；經(jīng)常規(guī)質(zhì)粒擴增、提純后制得重組質(zhì)粒DNA純品，以1 mg/ml的濃度溶于PBS(pH7.2)，即為乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s。1.2小鼠接種接種用Balb/C小鼠均為68周齡，清潔級，隨機分為實驗組和對照組。實驗組32只小鼠，每只小鼠兩側(cè)脛前肌處肌注NV-HB/s，接種劑量為每只100 g/100 l，兩側(cè)

10、各半量。設(shè)3個對照組，每組4只小鼠：空白對照組，用等體積的PBS(pH7.2)代替NV-HB/s肌注小鼠；陰性對照組，用等量空載質(zhì)粒pRc/CMV/ATG代替NV-HB/s肌注小鼠；陽性對照組，用血源乙型肝炎疫苗(成都生物制品研究所產(chǎn))肌注小鼠，1 g/只。1.3表達產(chǎn)物的檢測將實驗組小鼠隨機于接種后第3天、1周、2周、1月、2月、4月、6月分批采集眶靜脈血，分離血清置-70凍存?zhèn)錂z：同時處死小鼠，解剖檢查其內(nèi)臟器官，并分離出接種部位脛前肌標本，經(jīng)常規(guī)福爾馬林液固定后、石蠟包埋。待所有標本收集完成后，在同一條件下，用ELISA法檢測血清內(nèi)的抗-HBs及HBsAg(檢測試劑盒均購自華美生物工程公

11、司)；用ABC免疫組化法檢測石蠟包埋組織切片內(nèi)的HBsAg(檢測試劑盒購自美國VECTOR公司)，操作程序參照文獻2進行；此外，常規(guī)H.E.染色上述組織切片標本，顯微鏡下觀察其肌注局部組織內(nèi)的病理變化。2結(jié)果2.1肌注NV-HBs后HBsAg的表達及抗-HBs的誘生在接種NV-HBs后第3天時，尚未能在受檢小鼠中檢出HBsAg；接種后1周，則已能在受檢小鼠肌注局部組織中檢出HBsAg的表達，檢出率為33.3%；接種后2周，檢出率達100%，此時，外周血內(nèi)抗-HBs已出現(xiàn)陽轉(zhuǎn)，陽轉(zhuǎn)率為66.7%；此后肌注局部組織中的HBsAg檢出率和外周血抗-HBs檢出率均進一步增高(表1)。累計接種后1月起到

12、第6月本實驗結(jié)束時全部受檢的22只實驗鼠中，外周血抗-HBs檢測結(jié)果均全部呈陽性；并至少在75%的受檢鼠中，其肌組織內(nèi)HBsAg保持檢出陽性。此外，陽性對照鼠外周血抗-HBs檢測結(jié)果呈陽性；而陰性及空白對照鼠的HBsAg及抗HBs檢出結(jié)果則均呈陰性，符合實驗設(shè)計預(yù)期結(jié)果。 表1小鼠肌注NV-HBs后局部組織中HBsAg的表達及外周血中抗-HBs的檢出Tab.1HBsAg expression and anti-HBs induction in the mice inoculated withDNA vaccine against hepatitis B(NV-HB/s) by intramus

13、cular injection接種后的陽性率Positive rate after inoculation3d1wk2wks1mo2mos4mos6mosHBsAg0100757575(0/4)(1/3)(3/3)(3/4)(3/4)(5/6)(6/8)Anti-HBs00100100100100(0/4)(0/3)(2/3)(4/4)(4/4)(6/6)(8/8)     注：HBsAg的檢測用免疫組化法(ABC染色)，抗-HBs的檢測用ELISA法；括號中的數(shù)表示陽轉(zhuǎn)小鼠數(shù)/受檢小鼠數(shù)Notes:HBsAg was detected from mou

14、se muscle tissue samples of injected sites by ABC immunohistochemistry. Anti-HBs was detected from serum samples by ELISA.The numerals in parenthesis indicating The number of mice with positive detection resulats/the total number of mice detected另一方面，無論是接種乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s的實驗鼠、或是接種血源乙型肝炎疫苗的陽性對照鼠，雖然其外周

15、血抗-HBs均陽轉(zhuǎn)，但其血清標本內(nèi)均始終未能檢出HBsAg。2.2肌注NV-HB/s后局部組織的病理改變肌注后第3天處死的小鼠未見內(nèi)臟器官明顯改變。鏡下觀察接種局部肌組織，實驗鼠及對照鼠均可見玻璃樣變性，表現(xiàn)為肌細胞腫脹，橫紋消失，胞漿紅染。肌注NV-HB/s或空載質(zhì)粒pRc/CMV/ATG的小鼠肌細胞的局部變性灶范圍較肌注PBS者大，且伴有輕、中度的淋巴細胞聚集，其中1例肌注NV-HB/s的小鼠在肌注部位可見有中性粒細胞的浸潤。肌注PBS小鼠的上述病理改變在肌注后1周逐漸減輕，至注射后2周，已自行恢復(fù)正常；肌注NV-HB/s及空載質(zhì)粒的小鼠則在接種后4周完全恢復(fù)正常。3討論核酸疫苗系插入有目

16、的基因的真核細胞表達質(zhì)粒DNA，接種后可在體內(nèi)表達目的基因所編碼的蛋白；該蛋白即可作為抗原，誘生機體的特異性免疫應(yīng)答，達到免疫保護的目的，甚至可望用于治療慢性病毒感染乃至腫瘤3，4。本文接種小鼠用的核酸疫苗含有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)主蛋白S的編碼基因，肌注小鼠后1周內(nèi)，在局部肌組織已可檢出HBsAg主蛋白S的編碼基因，肌注小鼠后1周內(nèi)在局部組織已可檢出HBsAg的表達；隨后檢出率進一步增高，持續(xù)表達至接種后半年以上，同時伴有外周血抗-HBs的陽轉(zhuǎn)；接種血源乙型肝炎疫苗(HBsAg)的陽性對照鼠的血清抗-HBs亦同時能陽轉(zhuǎn)，而僅肌注空栽質(zhì)粒pRc/CMV/ATG或PBS的對照組小鼠HBs

17、Ag及抗HBs檢測則均系陰性。以上結(jié)果表明，核酸疫苗NV-HB/s的接種在小鼠體內(nèi)表達了HBsAg，并誘生出抗-HBs應(yīng)答。本組資料觀察到，在HBsAg檢出后1周，即小鼠肌注接種NV-HB/s后2周，即可在66.7%的受檢小鼠外周血內(nèi)檢出抗-HBs；在接種后16月分4批處死受檢的22只小鼠中，外周血抗-HBs均已全部陽轉(zhuǎn)，提示誘生出的外周血抗-HBs可持續(xù)至陽轉(zhuǎn)后5月以上，表明核酸疫苗NV-HB/s的接種實現(xiàn)了高效率的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。在上述的22只小鼠中，有5只盡管于處死當時在肌注局部表達的HBsAg尚未達到可檢出水平，但其外周血抗-HBs均已陽轉(zhuǎn)。這種外周血抗-HBs檢出率(ELISA法)

18、高于肌注部位組織HBsAg檢出率(免疫組化法)的現(xiàn)象，系因機體對抗原免疫應(yīng)答誘生抗體的過程中存在著放大效應(yīng)，以及兩種方法的檢測靈敏度存在著差異所致。Geissler等5進行了類似的研究，所報告的乙型肝炎核酸疫苗接種后的抗-HBs應(yīng)答規(guī)律與本文一致；惟該作者通過放射免疫技術(shù)，可在44%的受檢小鼠外周血內(nèi)檢測出低水平的HBsAg。而在本組資料中，盡管乙型肝炎核酸疫苗能在小鼠接種局部肌組織內(nèi)表達HBsAg，在其體內(nèi)誘生抗-HBs；但外周血內(nèi)的HBsAg則均未能達到ELISA技術(shù)的可檢出水平。且接種血源乙型肝炎疫苗的陽性對照鼠情況亦是如此。鑒于放免法的檢測靈敏度高于ELISA法，以上結(jié)果提示：陽轉(zhuǎn)鼠外周血流中的循環(huán)HBsAg是十分微量的；在其特異性體液免疫應(yīng)答誘生機制中扮演主要角色的免疫原，可能是存在于接種局部肌組織內(nèi)的HBsAg。本組資料也提示：接種乙型肝炎核酸疫苗后，在局部組織引起的病理改變可能主要系肌注注射所致的非特異性創(chuàng)傷性反應(yīng)。作者單位：610041成都華西醫(yī)科大學(xué)附一院四川省感染病分子生物學(xué)重點實驗室本課題受國家自然科學(xué)基金(項目號：39670670)及四川省“九五”攻關(guān)重大項目基金資助參考文獻1趙連三，秦山，李